孕早期流产胚胎组织检验在法医学中的应用

郭宁，冯敏,王巍巍，张旭，孟军，才笑寒，张曙光

(锦州市公安局刑侦支队，辽宁 锦州 121000)

在法庭科学DNA检验中强奸案件是主要的一大类案件，这类案件给被害人造成巨大的心理及生理上的伤害，在这类案件侦破中生物物证的作用显得尤其重要。目前在强奸案中有时会送检孕早期的流产组织，来进行亲权鉴定，锁定犯罪嫌疑人。

本实验室对收检的典型案件中的孕早期流产组织进行检验，均能获得完整的STR分型，为打击罪犯提供了强有力的技术支持。现结合本实验的检验情况，对孕早期流产组织在法医学中的检验及应用情况加以介绍。

1 孕早期流产组织检验的现状

早期的破坏性流产胚胎组织中,母体成分与胚胎成分的有效分离,一直是检验的难题，分离不彻底，往往造成在扩增时母体成分DNA出现优势扩增，影响胚胎组织的STR分型结果。目前国内外关于孕早期胚胎组织的检测研究主要集中在通过技术手段将母体组织和胚胎组织进行分离。常见的有手术刀片等手工显微切割技术、细胞分离检验技术(LCM)等。这些方式均具有各自的优缺点。

研究[1-2]表明，手术刀片等手工显微切割技术可以在流产组织中成功分离胚胎成分。但是手工显微切割技术需要操作人员具备足够的经验，操作也需要花费较长的时间，最主要的问题在于精度没有保证，且不能完全将母体成分去除，不能避免母亲成分对胚胎组织造成的污染。

LCM技术的发展在很大程度上解决了以上问题。通过LCM技术可以从流产的绒毛膜组织、胚胎组织、母体蜕膜组织、母体血液等混合组织中获得胚胎细胞,尽量避免母体成分的干扰,通过捕获200个绒毛细胞获得胚胎成分的DNA分型[3]。Bauer等[4]在2002年，首次将LCM技术应用于法庭科学中的孕早期流产胚胎组织的检验。他们利用LCM技术从流产组织中直接分离得到绒毛细胞，最大限度的去除母体成分的污染，成功获得单一的胚胎成分的STR分型进而准确进行亲权鉴定，但LCM技术在法医学领域的应用并不广泛。

本文采用的是最简单、最能在基层法医单位开展应用的方法，肉眼直接观察区分、水中直接剪取绒毛。该方法能够得以成功是利用了胚胎组织发育过程中胎膜和绒毛膜不同的形态特征。胚胎组织在6 w之后已经形成了的胎膜，完整的胎膜和胚胎呈现卵圆形，胎膜外侧的绒毛膜已经分化成三级绒毛[5]，在水中，绒毛膜分化的三级绒毛较子宫基蜕膜的绒毛长，并呈密集三级分叉的珊瑚状结构，母体的子宫内壁基蜕膜碎片的形状不规则，颜色多呈米白色或浅褐色，基蜕膜和其上的绒毛样结构颜色较胎膜和胚胎组织稍深，成短簇的绒毛态，不分叉[6]。在水中漂浮时，绒毛完全展开的状态下，在结构上可以明显的区分出来绒毛组织。对绒毛组织进行DNA检验，可以获得胚胎的STR分型。利用该方法在法医实际工作中对孕早期流产组织的检验有成功的报道[6]83-84。

2 孕早期流产组织DNA检验在法医学中的应用

2.1 经典案例

2.1.1 案例

案例一：2018年10月22日20时47分，某派出所接“110”指令，报警人称其被人强奸。出警到达指定地点，据被害人(14周岁)申某述称：自己于2018年8月中旬一天，在刘某家中被其强奸。

案例二：2018年12月24日12时52分，石某某报警称：2018年11月1日7时至2018年11月30日18时期间，其被一个叫张某某的人以“上网吧上网”为由带到北镇市青堆子镇六屯村550号北小桥南侧草苫堆边上，被张某某强奸。

两起案件报案时均距离案发时间较长，被害人均记不清具体的发案时间，精斑等已经不具备检验条件，故送检冷冻的被害人流产组织。

2.1.2 检验过程及检验结果

将冷冻的流产组织放置在无阳光直射处、室温解冻，待流产组织解冻后将其置于经过消毒的广口玻璃器皿中用超纯水反复冲洗，清洗时要用小水流，小心翻动，尽量洗净母体血液和组织[7]。冲洗至液体澄清无血色。

将冲洗干净的流产组织放置于面积较大的洁净容器中，加入能没过其的超纯水，用镊子将流产组织完全展开，使其漂浮在水中。可以看见灰白色绒毛浮在水面上，直接在水中剪取胚胎组织绒毛膜 1～2 mm，放置于0.6 mL的EP管中。用行标GA/T 383-2014中的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法(Chelex 100法)提取其DNA。

采用Promega PowerPlex21试剂盒进行PCR复合扩增；扩增产物经ABI-3130XL型DNA序列分析仪电泳分离和激光扫描分析，得到各检材的STR分型结果如下，见表1、表2。

表1 案例一送检的检材STR分型结果

表2 案例二送检检材的STR分型结果

2.1.3 结果分析与讨论

这两起案件均检出了流产组织、被害人及嫌疑人的STR分型结果。而且均符合生物学遗传规律，都能够为案件的侦破提供强有力的依据。

这两起案件检验成功的关键在检材的提取上，孕早期流产的胚胎组织，一般都是在医院进行流产后由办案民警送检。所以送检人要在提取后及时送检，正确保存，否则检材被破坏，会加大检验难度，甚至丧失检验条件。

送检的孕早期流产胚胎组织往往包含大量的血性液体，因此提取绒毛之前，一定要反复用超纯水清洗送检的流产组织，力争去除母体血液对胚胎组织的污染。

由于绒毛的DNA含量非常丰富，较常规物证用量要小很多。因此在扩增时要把握好模板的量、在电泳时要注意加样的量，以免造成等位基因峰高过高，不能获得满意的结果。

2.2 孕早期流产组织DNA检验在法医学中的应用

孕早期流产组织DNA检验在法庭科学中有着重要的意义。在强奸案件中，有没有性行为是主要的定罪环节，有时候犯罪嫌疑人会狡辩称在床单或者卫生纸上留下的精斑是其自慰产生的，并不存在性行为，往往给定案造成一定的困扰，但是如果流产的胚胎组织与嫌疑人具有生物学的亲缘关系，嫌疑人就失去狡辩的机会。而且一旦送检的是孕早期流产组织，这类强奸案往往是由于被害人自己疏忽、智力障碍或者被胁迫等原因，不敢或羞于报案，直到其亲属或者监护人发现异常时询问才会得知其被性侵的经历，但由于距离案发时间久远，精斑等体液类的生物物证基本已经失去检验条件，因此孕早期的流产组织成为关键且唯一的证据，也是唯一的希望。

由于孕早期流产组织的重要性，因此在提取、送检及检验过程中要谨慎。首先，在法庭科学日常检案过程中送检的早期胚胎组织通常为药流和人流两种不同方式产生的流产组织。送检时有着不同的要求，药物流产的需要送检全部的阴道排出物；而人工流产，需要送检手术中产生的所有固态物质。其次，在被害人去医院进行流产前，送检单位必须提前和就诊的医院、医生进行沟通，尽可能采取适当的流产方式，以保证提取到的孕早期流产组织尽可能的完整、唯一、避免胚胎组织和别的个体的流产组织相互混淆。为了防止污染，提取时需要用消毒后的洁净容器，提取全部的固体组织。再次，在送检人接到需要送检的流产组织时，要及时送检，这是由于孕早期流产组织含有大量的血性液体，容易发生腐败进而影响之后的DNA检验。如果实在由于特殊原因不能在第一时间送检时必须要冷冻保存，不能采取福尔马林固定。因为有研究[8-9]表明，福尔马林固定后的检材，由于在其生物大分子之间存在较多的亚甲基交联桥，增加了DNA分子的脆性，而且DNA与蛋白质形成较为牢固的复合体，不利于提取固定组织中的DNA。最后，提取到的孕早期流产组织均要求独立包装，在包装袋上写明案件名称、提取时间、送检人等信息，并且给其赋予唯一性标识，必要时需要拍照固定其原始的形态特征。

DNA室检验人员接到送检的孕早期流产组织后要立刻进行检验，如果不能及时检验需要继续冰冻保存。检验前要对检材进行预处理，首先室温解冻，解冻后用超纯水反复冲洗，以期尽可能多的去除流产组织中的血性液体，减少母体成分的污染。在冲洗过程中要小心轻柔，以防将绒毛组织冲掉，影响之后的提取。绒毛组织的提取采取的是水中直接剪取法，绒毛组织的形态在水中比较好辨认。三级绒毛就是孕早期流产胚胎组织检出STR分型的关键物证。但是需要注意的是有一部分孕早期的流产组织是手术切除的输卵管妊娠组织，由于怀孕时间短，胚胎很小，肉眼无法将胎儿和母体组织区分开来，这种情况下可以进行病理切片后借助光学显微镜，有针对性地选取所需要的胎儿绒毛组织[10]。也可以采取分段提取的方式，多剪取几处送检的输卵管组织，分别进行检验，可以获得成功的分型。

孕早期流产组织在法庭科学DNA检验中是一类常见但并不常规的检材，有些基层检验单位不具备检验条件，而且由于人力、物力、财力的限制，造成手术刀片等手工显微切割技术、细胞分离检验技术(laser capture microdissec-tion,LCM)不能在基层法医检验单位广泛的应用。因此这种肉眼直接观察区分、水中直接剪取绒毛的方法较为直接、简单、便于推广。但是这种方法需要检验人员有足够的经验，可以区分出绒毛组织，因此基层的法医单位要对人员进行培训，提高检验人员的技术水平，让孕早期流产组织的检验更好的发挥作用，为侦查破案、打击犯罪提供更有力的技术支持。