超高效液相色谱法检测土壤中硝基呋喃类药物残留

2020-06-03乌仁图雅邓宇荣迪王岩娜日娜陈琪赵剑平正月

化学分析计量 2020年3期

乌仁图雅，邓宇，荣迪，王岩，娜日娜，陈琪，赵剑平，正月

(内蒙古赤峰市农牧科学研究院，内蒙古赤峰 024031)

硝基呋喃类抗生素是用于治疗畜禽胃肠道疾病的药物或饲料添加剂。硝基呋喃类药物及其代谢产物具有一定毒性，可致癌、致突变的作用［1–3］。因此美国于1993 年禁止将呋喃唑酮用作兽药用于食品动物，欧盟也于1995 年全面禁止使用呋喃唑酮类抗菌药［4］，而我国农业部193 号公告已明令禁止对食用动物使用呋喃唑酮等硝基呋喃类药物［5］。尽管如此，由于此类药物高效廉价，有些不法商贩仍在继续使用。

我国是畜牧业生产大国，畜牧业综合生产能力位居世界前列。据统计每年我国畜牧养殖业抗生素使用量约为9.7 万吨［6］。许多用于畜禽生产的抗生素很难被动物肠胃完全吸收，约30%～90%随着粪便和尿液排出动物体外［7］。因含有大量的有机质、氮、磷等营养元素，畜禽粪便常被作为有机肥用于生产粮食和蔬菜的农田，从而使抗生素在农田土壤、地表和地下水中不断富集［8–9］，影响土壤中微生物种群、群落结构、耐药性等［10］。土壤中的抗生素通过根部进入植物体内，影响植物的根系发育、地上部分的生长及抑制叶绿体合成酶的活性［11］。还会造成抗生素在植物体内大量积累，通过食物链对动物和人体产生毒害风险，并对生态环境造成严重的污染［7，12–13］。

目前，硝基呋喃类的检测对象主要针对饲料、水体、动物源性食品和蜂胶等，主要检测方法有微生物法、免疫分析法、薄层分析法、高效液相色谱法、高效液相色谱–串联质谱法等［14–20］。其中，高效液相色谱法具有效率高、快速、灵敏度高等优点，是目前采用最多的方法之一。笔者采用超高效液相色谱法建立了高效、快捷、准确、灵敏的土壤中硝基呋喃类的检测方法，并对样品前处理进行了优化。该方法能够完全实现土壤中硝基呋喃类药物残留量的检测，准确、可靠地测定土壤中硝基呋喃类药物残留。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：1290 型，配紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司；

水浴恒温振荡器：SHY–A 型，金坛市成辉仪器厂；

数控超声波清洗器：KQ5200DE 型，昆山市超声仪器有限公司；

台式冷冻离心机：Multifuge X3R 型，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Rimedco 化学公司；

乙酸铵：分析纯；

实验用水为超纯水；

呋喃西林(NFZ)、呋喃妥因(NFT)、呋喃唑酮(FZD)、呋喃它酮(FTD)标准品：纯度不小于99.9%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 溶液配制

硝基呋喃类药物混合标准溶液：100 μg／mL，称取4种硝基呋喃类药物各10 mg(精确到0.000 1 g)于4 只100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至标线，超声溶解，于4℃下可以保存6 个月。

硝基呋喃类药物混合标准贮备液：10 μg／mL，精密量取100 μg／mL 的4 种硝基呋喃类药物标准贮备液各10 mL 于同一100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至标线。4℃下可以保存6 个月。

硝基呋喃类药物混合标准工作液：分别移取适量10 μg／mL 混合标准贮备液于6 只10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至标线，配制成硝基呋喃类药物含量均分别为0.1，0.2，0.5，1，2，4 μg／mL 的系列标准工作液。现用现配。

1.3 样品的采集和制备

土壤样品于阴凉处风干后，四分法分取2 kg 样品，全部通过0.5 mm 样品筛，放入自封袋中避光保存，备用。

1.4 样品处理

称取样品(2±0.02) g 于50 mL 离心管中，加入15 mL 乙腈–水（体积比为3∶2），振荡5 min，在35℃条件下超声提取15 min，离心10 min，重复提取3 次，上清液合并摇匀，置于50 mL 茄形瓶中，45℃旋转蒸发至近干，用含0.1%甲酸的乙腈–水充分溶解复溶至10 mL，作为样品溶液，待净化。

将HLB 柱安装与固相萃取装置上，依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化。将上述样品溶液通过固相萃取柱，用3 mL 水、3 mL 10%甲醇溶液淋洗、抽真空1 min，用甲醇洗脱，45℃旋转蒸发至近干，加10%乙腈水2 mL 溶解残余物，过0.2 μm 滤膜，供超高效液相色谱仪测定。

1.5 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，4.6 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：40℃；进样体积：20 μL；检测波长：365 nm；流量：1.0 mL／min；流动相：A 为0.05% 乙酸铵溶液(pH 值为4.8)，B 为乙腈，A 与B 的体积比为80∶20，等度洗脱。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

分别考察了磷酸、乙腈、水、甲醇、乙酸铵等单一或不同比例混合流动相体系下色谱分离效果。结果显示，流动相体系为0.05%乙酸铵水溶液–乙腈(体积比例80∶20)，调节pH 值为4.8，等度洗脱条件下4 种化合物色谱峰的分离效果良好，峰形尖锐。色谱图如图1 所示。

图1 4 种硝基呋喃类药物的色谱图

2.2 提取溶剂的选择

据文献报道从基质中提取硝基呋喃类药物残留物通常使用乙酸乙酯［15–16］、乙腈［17–18］、甲醇和缓冲盐［19–20］等。乙腈相对于甲醇有较低的吸光度和较强的脱洗能力，并且在相同的流量下不会对色谱柱产生多余的压力。硝基呋喃类药物的性质各不相同，溶解性也各有差异。

试验考察了不同配比的乙腈水溶液对4 种硝基呋喃类药物的提取效果。试验表明，不同配比的乙腈水提取溶液回收率不同，结果见图2。

图2 不同比例乙腈水提取液对回收率的影响

由图2 分析得出，在乙腈–水的体积比为3∶2时，4 种硝基呋喃类药物的回收率均较高，因此选择乙腈–水的比例为3∶2。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 超声时间对回收率的影响

当提取温度为45℃，提取次数为4 次时，设定超声时间分别为2，5，10，15，20 min 进行加标回收试验，结果见图3。

图3 超声时间对回收率的影响

由图3 分析得出，在超声时间为10 min 时，土壤中4 种硝基呋喃类药物的回收率均较高。

2.3.2 提取温度对回收率的影响

当超声时间10 min、提取次数4 次时，设定提取温度分别为25，35，45，55，65℃，进行加标回收试验，结果见图4。由图4 可知，在提取温度为45℃时，土壤中4 种硝基呋喃类药物的回收率均较高。

2.3.3 提取次数对回收率的影响

当超声时间10 min、提取温度为35℃时，设定提取次数分别为1，2，3，4，5 次，进行加标回收试验，结果见图5。

图4 提取温度对回收率的影响

图5 提取次数对回收率的影响

由图5 分析得出，在提取次数为4 次时，土壤中4 种硝基呋喃类药物的回收率均较高。

2.4 正交试验

根据单因素试验结果，选取超声时间为5，10，15 min；提取温度25，35，45℃；提取次数2，3，4 次，进行正交试验，正交试验设计见表1。正交试验分析与结果见表2。

表1 正交设计表

表2 正交结果统计表

通过极差分析得出，对回收率的影响主次顺序为B ＞A ＞C，最优组合为A3B2C3，即超声时间为15 min，提取温度为35℃，提取次数为4 次。

2.5 线性范围和检出限

按1.4 色谱条件测定1.2 配制的系列混合标准工作溶液，以色谱峰面积(Y)对浓度(X)绘制标准曲线，进行线性回归，线性方程、相关系数见表3。结果表明，硝基呋喃类药物的质量浓度在1～4 μg／mL 范围内线性良好，相关系数均大于0.999 9。以不含目标物的空白土壤样品为基准，添加硝基呋喃类药物混合标准溶液，按照1.4 方法处理，分别以3 倍和10 倍的信噪比计算出方法检出限和定量限。土壤样品中硝基呋喃类药物的检出限分别为NFZ 0.16 mg／kg，NFT 0.14 mg／kg，FZD 0.16 mg／kg，FTD 0.12 mg／kg；定量限分别为NFZ 0.34 mg／kg，NFT 0.30 mg／kg，FZD 0.34 mg／kg，FTD 0.27 mg／kg。

表3 线性方程、线性相关系数、检出限与定量限

2.6 加标回收与精密度试验

以不含目标物的样品为空白样品，分别添加高、中、低3 个浓度的混合标准溶液，按1.4 进行处理，在1.5 色谱条件下测定，计算回收率及相对标准偏差，结果见表4。土壤空白样品和加标样品的色谱图见图6。由表4 可知，4 种硝基呋喃类药物的回收率为74.34%～102.52%，测定结果的相对标准偏差为0.91%～4.49%(n=6)，说明该方法具有良好的精密度与准确度。