金叶连翘叶片色素含量和解剖结构研究

孙旺旺 孟宪敏 徐秀源 伍敏华 秦梦阳 林梦梦 张新妍 岳国忠*

(1.河北科技师范学院园艺科技学院，秦皇岛 066004； 2.北京农业生物技术研究中心，北京市农林科学院，北京 100097； 3.国家蔬菜工程技术研究中心，北京市农林科学院，北京 100097； 4.唐山植物园，唐山市园林绿化管理局，唐山 063000)

金叶连翘(Forsythiakoreana‘Sun Gold’)隶属于木犀科(Oleaceae)连翘属(ForsythiaVahl)，又名黄金条、金叶朝鲜连翘，是朝鲜连翘(F.koreana)由叶色变异经多次选育嫁接而培育出来的黄叶变种[1]。金叶连翘冠层上位成熟叶片常年呈黄色，其生态适应性强，具有抗旱、抗寒的特点，能耐受-30℃以下低温，为园林色块布置的优良彩叶植物[2]。

通常，高等植物的叶片中主要含有叶绿素、类胡萝卜素和花色素苷等光合色素，叶绿素含量通常大于类胡萝卜素含量，从而使得植物叶片呈现绿色[3]。但因叶绿素较易被破坏或降解，导致叶绿素含量的不同往往直接表现为叶色的不同，此类突变体通常被称为叶绿素突变体[4]，彩叶植物多属于此类型。前人研究表明，黄化叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均大幅减少，而总叶绿素含量减少是导致叶片黄化的主要原因[4～5]；而王欢利等[5]认为金叶植物主要表现为总叶绿素含量及总叶绿素/类胡萝卜素比值的降低，而与叶片花青素含量无关。叶绿素含量降低通常导致叶绿体发育缺陷，异常的叶绿体结构会改变各种色素的含量及比例，从而导致叶色变异[6]。对于黄化叶片的色素含量及叶绿体超微结构的研究，至今已在小麦[7～8]、水稻[9]、芝麻[10]、甘蓝[11]、乌桕[12]、花叶线艺兰[13]和‘金薇’[14]等植物中开展。一般认为，黄化突变体的叶绿体结构较为简单，基粒和基粒片层数目少，或未分化出基粒和基粒片层；而有些黄化突变体，不仅叶绿体发育存在明显缺陷，且叶绿体数目较少[5]。叶绿体的发育按照时序可以分为3个阶段：前叶绿体时期、单片层形成期和基粒形成期[15]，因此，叶绿体发育停滞于不同时期也会影响叶片颜色[16]。有研究发现，由于表皮细胞与栅栏组织细胞间或栅栏组织内的大量间隙(气室)会使得入射光大量反射，造成叶片呈现白色[17]；叶片表皮绒毛、表皮蜡质的存在以及其他结构变化会使植物叶片呈现白色或蓝晕色[18～19]。由于叶绿体主要存在于栅栏组织细胞内，袁明等[20]研究表明栅栏组织细胞和海绵组织细胞的叶绿体大小和数量存在明显差异，所以本试验主要针对栅栏组织部位叶绿体进行研究。

近年来，金叶连翘在北方园林绿化中应用越来越受到重视，研究其呈色机理对合理地开发金叶连翘资源，更好地发挥其生态意义和景观价值具有十分重要的意义。但是，关于金叶连翘呈色机理尚未见报道。目前，对彩叶植物呈色机理的研究多集中于叶片色素含量、叶绿体超微结构等方面，但少见观察叶片横切面显微结构的研究。本试验以朝鲜连翘成熟叶片(深绿色)为对照，以金叶连翘冠层上、中和下位成熟叶片为研究对象，从叶片色素含量、叶绿体超微结构和叶片横切面显微结构3个方面进行探讨，以期为金叶连翘叶片呈色机理研究提供指导和借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用种植于河北科技师范学院昌黎校区试验站的生长状况良好、长势基本一致的3年生朝鲜连翘(CK)和金叶连翘为试材，实验取样均在2017年6月进行。

1.2 叶片形态特征

于2017年6月25日上午9:00～11:00选取2年生枝条上的当年生的长势和叶龄基本一致的成熟叶片。以朝鲜连翘成熟叶片为对照，比较金叶连翘冠层上、中和下位的3种成熟叶片的颜色和大小。每冠层和对照各取15片叶进行比较，共3次重复。

1.3 叶片色素含量测定

参照张宪政[21]的试验方法。将叶片洗净擦干，去掉主叶脉和叶柄，剪碎，称取0.1 g叶片放入盛有10 mL 80%丙酮∶95%乙醇=1∶1混合提取液的试管中，密封，遮光，4℃浸提24 h左右，至叶片变白，过滤。以提取液为参比液，用岛津-765s分光光度计在663、645及440 nm波长处测定光密度值(OD值)，再根据公式计算总叶绿素(Chla+b)、叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和类胡萝卜素(Car)的含量。所有测定均设3次独立取样试验。

1.4 叶片解剖结构1.4.1 叶绿体超微结构观察

参照付洪兰[22]的方法。将叶片主脉中段切取4 mm×1 mm的长条；投入4%戊二醛固定液中，抽真空，固定24 h以上；用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.2)漂洗，再用1%锇酸固定2 h；乙醇梯度脱水，环氧树脂Epon812包埋；采用Leica EMUC 6超薄切片机切片，醋酸双氧铀硝酸铅染色；在日立H-7650透射电子显微镜下观察栅栏组织并拍照。

1.4.2 叶片横切面结构观察

参照李和平[23]的方法。取叶片中下部主脉一侧约5 mm×5 mm的小片，投入FAA固定液中，抽真空，固定24 h以上，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚度1.2～1.5 μm)，番红—固绿染色，加拿大中性树胶封片制备成样品切片。每个样品选取10张切片，每张切片随机选3个视野，在Zeiss Axiao Lab. Al显微镜及其成像系统下观察，拍照。测量叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度及海绵组织厚度并计算栅栏组织/海绵组织(栅/海比)。所有测定均设3次独立取样试验。

1.5 数据处理

数据采用Excel 2010软件进行统计分析，采用SPSS 20.0软件中的Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同叶色类型成熟叶片形态特征

一般情况下，在生长季内，朝鲜连翘(CK)成熟叶片只表现为深绿色(图1A)，而生长成熟期的金叶连翘不同冠层部位成熟叶片颜色和叶面积存在明显差异，冠层上、中、下位成熟叶片分别呈现为黄色、黄绿色和浅绿色，其黄叶和黄绿叶的叶面积分别为12.81和13.44 cm2，极显著小于自身浅绿叶和对照(P<0.01)(见表1，图1)。

表1 不同叶色类型叶片颜色和叶面积

Table 1 Leaf color and area of different leaf color types

冠层Tree canopy叶色Leaf color叶面积Blade area(cm2)对照CK深绿色Deep green23.24±2.55Aa上Top黄色Yellow12.81±1.92Bb中Middle黄绿叶Yellow green13.44±1.82Bb下Bottom浅绿色Light green22.82±1.92Aa

注：数据为平均值±标准误差表示；同列不同小写字母表示5%水平上显著，同列不同大写字母表示1%水平上显著；下同。

Note:The data form are mean values±standard error;Different lowercase letters in the same column indicate significant at 5% level,and different capitals in the same column indicate significant at 1% level.The same is as below.

图1 不同叶色类型叶片形态特征 A.朝鲜连翘深绿叶(CK)；B～D.金叶连翘冠层上、中、下位叶Fig.1 Morphological characteristics of leaves with different leaf color types A.Deep green leaves(CK) of F.koreana; B-D.Leaves of the top,middle and bottom canopy of F.koreana ‘Sun Gold’,respectively

表2 不同叶色类型叶片色素含量

2.2 不同叶色类型成熟叶片相关色素含量比较

由表2可知，金叶连翘3种成熟叶片的总叶绿素含量均低于对照，达到极显著水平(P<0.01)，黄、黄绿、浅绿叶分别是对照的0.51%、4.44%和66.47%。而金叶连翘黄、黄绿叶的总叶绿素含量差异不显著(P>0.05)，但均极显著低于浅绿叶(P<0.01)，分别是浅绿叶的0.76%和6.69%。黄、黄绿叶的类胡萝卜素含量均高于其总叶绿素含量，总叶绿素/类胡萝卜素比值均极显著低于对照和浅绿叶(P<0.01)，分别为0.55和0.56，一般情况下总叶绿素含量/类胡萝卜素约为3[17～20]。此外，黄绿叶的叶绿素a/b显著高于黄叶、浅绿叶和对照(P<0.05)。总叶绿素含量降低、总叶绿素/类胡萝卜素比值降低与金叶连翘叶片呈黄、黄绿和浅绿色有关。

2.3 不同叶色类型成熟叶片叶绿体超微结构比较

对照的栅栏组织细胞内叶绿体紧密排列于细胞壁上，明显呈纺缍形或梭形，部分叶绿体呈多边形或锥形；叶绿体被膜清晰且完整，类囊体基粒分布较为均匀，基粒片层垛叠层数较多，排列致密有序；淀粉粒体积较大，嗜锇颗粒分散且数量少、体积大(见图2:A1～A3)。相比对照，金叶连翘3种不同叶片的叶绿体结构均存在明显差异。黄叶栅栏组织细胞内的叶绿体数量极少，体积小，呈球形或不规则形状，内部有单片层类囊体(原片层体)(见图2:B1～B3)；无淀粉粒，积累了较小的嗜锇颗粒，且部分叶绿体降解严重，膜被严重破损(见图2～B2)；此外，细胞质中有同心圆状排列的多层膜结构(见图2:B3)。黄绿叶栅栏组织细胞内叶绿体数量较少，体积较小，呈纺锤形或球形，类囊体分化出片层，无淀粉粒，嗜锇颗粒数量多，叶绿体被膜模糊且部分破裂(见图2:C1～C3)；部分叶绿体内有空腔和透明的囊泡(见图2:C2)；有些叶绿体内含有半透明的不规则球形结构(见图2:C3)，可能是用于类囊体系统构建的膜结合颗粒包涵物[24]。浅绿叶栅栏组织细胞内叶绿体数量较多，呈纺锤形或梭形，中间稍微向细胞中间膨大；叶绿体被膜模糊，淀粉粒体积巨大且数量多，受淀粉粒的挤压，类囊体片层扭曲；基粒片层垛叠较多，但片层肿胀，嗜锇颗粒数量较少、体积较大(见图2:D1～D3)。

2.4 不同叶色类型成熟叶片横切面显微结构比较

对照和金叶连翘3种叶片横切面显微结构相同，均由上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮组成；与对照相比，金叶连翘3种叶片横切面结构中并没有出现大量间隙(气室)(见图3)。对照显微结构切片着色较深，栅栏组织细胞细长，排列较紧密(见图3A)。但是，金叶连翘黄色叶片显微结构切片着色较浅，栅栏组织细胞形态难以辨别，可能是黄叶栅栏组织细胞内细胞器解体所致(见图3B)；此外，黄绿叶上表皮细胞有凸起的现象(见图3D)。

由表3可知，金叶连翘3种不同叶片的栅栏组织、海绵组织、上表皮、下表皮厚度及栅/海比差异不显著，但均与对照存在显著差异。其中，黄叶、黄绿叶和浅绿叶的叶片厚度分别较对照降低34.70%、52.17%和44.62%；黄叶、黄绿叶和浅绿叶的栅栏组织厚度分别较对照降低59.47%、33.44%和32.37%；黄叶、黄绿叶和浅绿叶的栅/海比分别较对照降低50.48%、56.83%和37.46%。金叶连翘3种不同叶片仅有黄叶与黄绿叶的叶片厚度存在极显著差异，一般认为强光照能使叶片增厚[20]。由分析可知，金叶连翘3种不同成熟叶片的颜色与其横切面解剖结构特征无关。

图2 不同叶色类型叶片叶绿体超微结构 A.朝鲜连翘深绿叶(CK)；B～D.金叶连翘黄色叶、黄绿叶、浅绿叶 CW.细胞壁；CH.叶绿体；ME.叶绿体被膜；G.基粒；S.淀粉粒；O.嗜锇颗粒；V.囊泡；PLB.原片层体；CC.同心圆结构Fig.2 Chloroplast ultrastructure of leaves with different leaf color types A. Deep green leaves of F.koreana(CK); B-D. Leaves of the yellow,yellow green and light green leaves of F.koreana ‘Sun Gold’,respectively CW. Cell walls; CH. Chloroplasts; ME. Membrane envelop of chloroplast; G. Granulation; S. Starch granules; O. Osmium particles; V. Vesicle; PLB. Prolamellar body; CC. Concentric circles

图3 不同叶色类型叶片解剖结构比较 A.朝鲜连翘的深绿叶(CK)；B～D.金叶连翘黄色叶、黄绿叶、浅绿叶 UP.上表皮；PT.栅栏组织；ST.海绵组织；AC.气腔；S.气孔Fig.3 Anatomical structure comparison of leaves with different leaf color types A.Deep green leaves(CK) of F.koreana; B-D.Leaves of the yellow,yellow green and light green leaves of F.koreana ‘Sun Gold’,respectively UP.Upper epidermis; PT.Palisade tissue; ST.Spongy tissue; AC.Air cavity; S.Stoma

表3 不同叶色类型叶片横切面厚度

3 讨论

Falbel等[25]根据叶绿素b含量减少将叶绿素突变体比值划为两类：一类为完全不含叶绿素b的突变体，如拟南芥突变体[26]、大麦突变体chlorina f2[27]；另一类为总叶绿素及叶绿素b合成减少突变体，目前报道的突变体以后者居多。本研究表明，金叶连翘的黄叶、黄绿叶的总叶绿素含量分别是对照的0.51%和4.44%，是自身浅绿叶的0.76%和6.69%，且黄绿叶的叶绿素b含量降低幅度大于叶绿素a，表明金叶连翘属后者。肖华贵等[4]研究表明，油菜黄化突变体的总叶绿素/类胡萝卜素比值降低，约为对照的0.5倍；张振宇等[14]发现‘金薇’总叶绿素下降幅度大于类胡萝卜素，总叶绿素/类胡萝卜素比值降低至1.26～2.08，是导致‘金薇’形成黄叶的直接原因。本研究发现，黄、黄绿叶片总叶绿素/类胡萝卜素比值分别为0.547和0.556，极显著低于浅绿叶和对照(P<0.01)。类胡萝卜素的相对含量提高，能以叶黄素循环方式来消耗过剩的光能，使叶绿素免受光氧化作用的损坏[28]。金叶连翘属阴性植物，推测是在全光照条件下为避免叶绿素被损坏，其类胡萝卜素相对含量提高，进一步证实叶绿素/类胡萝卜素比值降低导致金叶连翘冠层上、中位叶片呈黄、黄绿色。

叶绿素含量降低往往伴随着叶绿体结构的异常，异常的叶绿体结构进而会影响叶片的颜色[6]。本研究表明，金叶连翘3种叶片总绿素含量降低的同时叶绿体发育均出现异常。黄叶和黄绿叶的叶绿体发育不完善，内部结构简单，无明显膜被结构，基粒和基粒片层数较少，与油菜[4]、小麦[7]、水稻[9]、芝麻[10]黄化突变体的研究结果相似。范燕萍等[13]认为嗜锇滴是因叶绿体中脂质合成与膜系统形成之间的代谢作用的不平衡而产生的，随着膜系统的崩解，构成膜的脂质成分与存在于基粒中的类胡萝卜素得以积累。本研究表明，黄叶、黄绿叶的叶绿体内有较多嗜锇颗粒，说明处于单片层时期的叶绿体正在降解，另外，黄叶细胞质中有特殊同心圆结构，可能是发育为叶绿体的前质体[29]。因此，叶绿体发育停滞和降解可能是金叶连翘出现黄叶、黄绿叶的原因之一。与黄叶相比，黄绿叶的叶绿体发育相对完善，叶绿体类囊体开始分化；与对照相比，黄绿叶的叶绿体数量偏少，叶绿体类囊体内膜总量少且发育程度低，内膜凹陷，开始形成独立的类囊体片层，有少量透明的‘囊泡’。这与初志战等[16]在水稻黄绿叶中发现的现象相似，但是本研究发现金叶连翘黄绿叶叶绿体内部有空腔。与对照相比，浅绿叶的叶绿体结构都比较完整，但是浅绿叶叶绿体类囊体基粒片层垛叠较多，片层肿胀且扭曲，这是由于冠层底部的浅绿叶，光照强度较低，光合速率较低，淀粉粒积累，压类囊体受巨大淀粉粒的挤压所致[30]；另外与对照相比叶总绿素含量呈极显著降低。因此，类囊体膜结构异常和总叶绿素降低与金叶连翘叶片呈现浅绿色有关。

根据彩叶的形成原因不同，可将彩叶划分为色素型和结构型[31]。其中结构型分为：①气室型，如王振兴等[17]发现狗枣猕猴桃叶片呈白色主要是由于栅栏组织层含有大量气室，入射光大量反射，造成叶片呈现白色；②表皮型，如Thomas等[19]发现藤卷柏叶片表皮细胞上有蜡质结构附着，叶片呈蓝色。袁明等[17]认为金叶女贞适应不同冠层部位的小环境变化，通过调整气孔特性、栅栏组织和海绵组织的厚度和细胞大小、叶绿体的结构和数量以及光合色素的含量等与光合作用相关的结构，分化出黄化叶。而本研究表明，金叶连翘上下表皮均没有发现明显的腺毛和蜡质，说明没有特殊附着物使金叶连翘叶色变黄；金叶连翘叶片栅栏组织排列紧密，没有特殊的气室结构，表皮细胞上没有蜡质结构附着，栅栏组织和海绵组织的厚度没有显著差异。因此，金叶连翘叶片没有特殊显微结构影响其叶色。

本研究表明，不同冠层的金叶连翘叶片呈现不同的颜色与总叶绿素含量、总叶绿素/类胡萝卜素比值、叶绿体结构及叶绿体发育程度有关。植物叶色是复杂生理生化代谢的体现，受到诸多方面因素的影响，如光照、温度和水分等，因此金叶连翘叶片呈色的机制有待进一步深入研究和完善。本研究还发现，黄绿叶叶绿素a/b比值显著高于其他叶片，且存在上表皮细胞凸起现象。按叶片颜色渐变规律来看，黄叶或浅绿叶应该是这种现象，可结果并非如此，这一现象有待进一步研究。