重组GSTA3蛋白对福美双诱导的肉鸡TD中抗凋亡基因BAG-3表达的影响

李桢，杨世雄，牛胜，张宁，李欣，张阳阳，贾云飞，田志雄，宁官保，张鼎，田文霞

重组GSTA3蛋白对福美双诱导的肉鸡TD中抗凋亡基因BAG-3表达的影响

李桢，杨世雄，牛胜，张宁，李欣，张阳阳，贾云飞，田志雄，宁官保，张鼎，田文霞

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

【】肉鸡胫骨软骨发育不良（TD）是肉鸡常见的一种骨骼性疾病，研究重组GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡软骨细胞中抗凋亡基因BAG-3表达的影响，为治疗TD提供新的思路和方法。将120羽1周龄肉雏鸡随机分为6组（编号为A、B、C、D、E、F组）。A、B、C组为基础日粮对照组，D、E、F组为添加福美双日粮诱导TD组。试验饲喂福美双2 d诱发TD，在添加福美双第1、3、5、7天，腿部肌肉注射重组鸡GSTA3蛋白和磷酸盐缓冲液，A组与D组注射（100 μg·kg-1）磷酸盐缓冲液；B组与E组注射低剂量（100 μg·kg-1）GSTA3；C组与F组注射高剂量（200 μg·kg-1）GSTA3。试验历时23 d。添加福美双后1、2、4、6、10和15 d采集胫骨生长板。通过Real-time qPCR检测BAG-3基因的mRNA水平，利用免疫组化来检测BAG-3蛋白表达水平。Real-time qPCR结果显示，TD损伤修复期内，相比较于基础日粮对照组，福美双对照组肉鸡胫骨生长板中BAG-3 mRNA的表达水平基本都显著上调（＜0.05）；相比较于福美双对照组，E和F组在第2、4、10、15天都有显著差异，且在第10和15天显著低于福美双对照组（＜0.05），表明与D组相比恢复较快。免疫组化结果表明BAG-3蛋白在肉鸡胫骨软骨细胞的增殖区和前肥大区无表达，只在肥大区细胞质中表达；福美双组与空白对照组相比，BAG-3蛋白表达增加；福美双高低剂量组与未注射蛋白的福美双组相比，重组GSTA3增加了肥大区的蛋白表达水平（第10和15天）。在福美双诱导肉鸡发生TD的过程中，GSTA3重组蛋白能够通过调控BAG-3表达参与凋亡途径，抑制细胞凋亡。在TD损伤修复期，注射GSTA3后使抗凋亡基因BAG-3蛋白表达增强，从而可参与细胞凋亡来缓解TD损伤，使得肉鸡TD生长板功能较快地恢复正常。

谷胱甘肽S-转移酶A3（GSTA3）；胫骨软骨发育不良；BAG-3基因；抗凋亡；肉鸡

0 引言

【研究意义】肉鸡胫骨软骨发育不良（tibial dyschondroplasia, TD）是一种肉鸡常见的骨骼疾病，胫骨生长板形成无血管的软骨栓，使肉鸡的胫骨软骨内成骨受阻[1]。TD是目前危害肉鸡业的主要代谢病之一，其致病机理尚不清楚，目前仍无有效的防治方法，TD的发病机制可能与生长板软骨细胞相关凋亡基因的表达调控有关[2]。【前人研究进展】Rath等研究了3种二硫代氨基甲酸二甲酯诱导TD发生，其中福美双效果最为显著，通过饲喂福美双的方法，可在短时间内建立与自发TD临床表现相似的动物模型[3]。谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是机体内一类十分重要的酶，由Booth等在1961年首次发现[4]。GSTs有3个亚族，分别为微粒体GSTs、细胞质GSTs、细菌磷霉毒抗性GSTs[5]。当机体在恶劣条件下，它通过催化某些内源性或外来有害物质的电子基团与还原型谷胱甘肽的疏基结合，保护细胞使其不受损伤[6]。GSTA3蛋白与已知的GSTs其他酶对催化类固醇激素生物合成的过程相比更有效[7]。田文霞等基因芯片检测结果发现GSTA3基因表达下调，福美双可能影响了GSTs的解毒功能，从而导致肉鸡TD的发生[8]。Bcl-2家族蛋白作为细胞凋亡的主要调控因子，主要定位于核膜、内质网和线粒体外膜上[9]，Bcl-2相关抗凋亡蛋白3（Bcl-2associated athanogene 3，BAG-3）也被称为Bis或CAIR- 1，是抗凋亡基因BAG家族的成员之一，Bcl-2相关抗凋亡家族的C末端均有一段高度保守的功能区域[10]，因此其进化高度保守。BAG-3通过免疫共沉淀、酵母双杂交及免疫染色等研究发现BAG-3能够与Bcl-2相互作用，共同发挥抗调亡作用[11]。BAG-3是一种生存蛋白，在细胞对高温、重金属、蛋白酶体抑制和人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）感染等应激条件的反应过程中被激活而发挥作用[12]。在急性应激和细胞老化过程中，BAG-3可激活蛋白质量控制（PQC）系统使细胞蛋白质稳定，也可参与清除与年龄相关的神经退行性疾病相关的蛋白[13]。BAG-3是骨骼肌机械转导的必要条件，在免疫系统中发挥重要调节作用[14]。Rath等与山西农业大学动物科技学院兽医生物制品实验室的前期研究发现福美双可引起血管内皮细胞及软骨细胞凋亡，但是BAG-3在TD肉鸡中软骨细胞的表达情况、GSTA3与细胞凋亡及BAG-3存在什么关系，尚未见相关研究。【本研究切入点】本研究团队前期研究结果显示，重组GSTA3蛋白可能在福美双诱导的TD中发挥重要作用，但其对抗软骨细胞凋亡的作用如何，有待进一步研究。【拟解决的关键问题】本试验通过免疫组织化学技术和Real-time PCR技术，研究福美双诱导的肉鸡TD中抗凋亡基因BAG-3的表达以及鸡重组GSTA3蛋白对BAG-3表达的影响，探讨GSTA3与BAG-3的关系，以及对TD恢复的作用，为后期对TD的治疗提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 120只1日龄艾维茵（AA）肉雏鸡购于山西大象农牧集团有限责任公司。

1.1.2 试验试剂 福美双（美国Amresco公司）；重组鸡GSTA3蛋白[15]（实验室自行制备）；BAG-3一抗（bioworld生物公司）；RNAiso plus（Trizol）（AA909-1）（大连宝生物工程公司）、prime script TM RT Reagent Kit（AK3020）（大连宝生物工程公司）、SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（AK6003）(大连宝生物工程公司)；DEPC（Amresco公司）；6×DNA loading buffer（中科瑞泰生物科技有限公司）、DNA ladder（中科瑞泰生物科技有限公司）；50×TAE Buffer（北京博奥拓达科技有限公司）、Agarose-G10（Biowest公司）；甲醛、异丙醇、异戊醇、乙醚、氯仿、氯化钠、无水乙醇、盐酸、二甲苯、EDTA均为国产分析纯试剂。

1.1.3 试验地点 试验于2017年7月至9月，在山西农业大学动物科技学院兽医生物制品实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 肉鸡TD模型建立及生长板的采集 120羽一日龄AA肉鸡饲养7 d，随机分六组（编号为A、B、C、D、E、F组）。A、B、C组为基础日粮组，D、E、F组为福美双日粮组（第8、9日龄在饲料中添加福美双）。第8、10、12、14天，腿部肌肉注射重组鸡GSTA3蛋白，A组与D组注射（100 μg·kg-1）磷酸盐缓冲液；B组与E组注射低剂量（100 μg·kg-1）GSTA3；C组与F组注射高剂量（200 μg·kg-1）GSTA3（表1）。试验历时23 d。攻毒后，分别在第1、2、4、6、10、15天，每组选3羽，取胫骨生长板，一部分固定用于免疫组化；一部分冻存，用于定量PCR检测。

1.2.2 免疫组织化学技术检测BAG-3蛋白的表达 将各处理组的胫骨生长板用4%的甲醛溶液固定24 h，修块后固定24 h，置于10%的EDTA中脱钙24 h，用梯度酒精（50%、70%、75%、80%、90%、100%）脱水2 h，在无水乙醇与二甲苯的1﹕1混合液中20 min，用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ依次透明35 min后，包埋，制片，染色，利用显微镜观察BAG-3蛋白定位及阳性表达结果。

1.2.3 总RNA提取及反转录 采用Trizol改进法进行RNA的提取，具体操作方法参考喻进[16]的方法进行。根据prime scriptTMRT Reagent Kit的说明书进行反转录，去除基因组DNA，所有操作在冰上完成，最后置于-80℃保存。

1.2.4 Real-time qPCR检测BAG-3基因mRNA的表达 采用Real-time qPCR对BAG-3基因mRNA的表达进行检测（表2）。Real-time qPCR反应体系如下：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq II（2×），0.25 μL PCR Forward Primer（10 μmol·L-1），0.25 μL PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1），0.1 μL ROX Reference DyeⅡ（50×），1.0 μL RT反应液（cDNA溶液），3.4 μL ddH2O。反应条件：预变性反应 1 cycle，95℃ 3 min；PCR反应 42 cycles，95℃ 30 s，55℃ 30 s；溶解曲线分析1 cycle，55℃ 30 s，95℃ 30 s。然后利用2.0% 的琼脂糖凝胶电泳对PCR反应产物进行鉴定。以18S rRNA作为内参基因，并用2-△△Ct法计算目的基因在胫骨生长板的相对表达量。

表2 Real-time PCR所用引物

F代表上游引物；R代表下游引物 F means forward primers, R means reverse primers

1.2.5 数据分析 用SPSS Statistics 17.0软件对计算出的各组数据进行差异显著性分析，＜0.05即为差异显著，差异性的结果按照统计学标注方法来区分显著性。

2 结果

2.1 肉鸡生长板BAG-3蛋白表达的情况

免疫组化结果发现，BAG-3蛋白主要在肉鸡胫骨软骨细胞的肥大区表达，增殖区和前肥大区均未表达，定位于细胞质中。试验第1天，与空白对照组（A）相比，低剂量和高剂量的基础日粮组（B和C）及低剂量和高剂量福美双组（E和F）无明显变化，而福美双对照组（D）表达明显增强（图1）；试验第2天，A组与B、C组表达无明显变化，D、E与F组表达一致（图2）；试验第4天，E组相比D、F组相对减少，趋于正常，和A、B、C组表达情况一致（图3）；试验第6天，D表达稍弱，其他无明显差异（图4）；试验第10天，A、B、C表达无明显差异，D表达增强，E、F相比D表达较弱（图5）；试验第15天，A、B、C表达无明显差异，D强于E、F（图6）。

2.2 重组GSTA3蛋白对TD肉鸡中BAG-3 mRNA水平的调节

A.基础日粮+注射PBS；B.基础日粮+100 μg·kg-1重组GSTA3蛋白；C.基础日粮+200 μg·kg-1重组GSTA3蛋白；D.福美双日粮+注射PBS；E.福美双日粮+100 μg·kg-1重组GSTA3蛋白；F.福美双日粮+200 μg·kg-1重组GSTA3蛋白；不同的小写字母表示差异有统计学意义（＜0.05）。

P.增殖区；PH.前肥大区；H.肥大区。下图同

图4 第6天肉鸡生长板BAG-3表达变化

图5 第10天肉鸡生长板BAG-3表达变化

图6 第15天肉鸡生长板BAG-3表达变化

图7表明，TD损伤修复期内，相比较于基础日粮对照组，福美双对照组肉鸡胫骨生长板中BAG-3 mRNA的表达水平基本都显著上调（＜0.05）；相比较于福美双对照组，E和F组在第2、4、10、15天都有显著差异，且在第10和15天显著低于福美双对照组（＜0.05），表明与D组相比恢复较快，并与蛋白表达相一致。

A. 基础日粮组+ PBS； B. 基础日粮组+100 μg·kg-1重组GSTA3蛋白； C. 基础日粮组+200 μg·kg-1重组GSTA3蛋白； D. 福美双日粮组+ PBS； E. 福美双日粮组+100 μg·kg-1重组GSTA3蛋白；F. 福美双日粮组+200 μg·kg-1重组GSTA3蛋白；不同小写字母表示差异有统计学意义（P＜0.05）

3 讨论

田文霞等和张宁等用福美双诱导TD后，胫骨近端软骨增殖区增厚，前肥大区和肥大区加长，软骨细胞急剧增生、大量调亡[2,17]。Rath等采取TUNEL法研究发现，在22日龄TD明显时，有大量的毛细血管内皮细胞和软骨细胞凋亡[18]。细胞凋亡由不同群体执行者和调控分子及其特异性功能所调控[19]。抗凋亡基因BAG-3表达越多，表明越能抵抗细胞凋亡。

BAG-3主要分布于细胞质，在机体中起抵抗细胞癌变，提高细胞存活率的作用[20]，参与细胞凋亡调控是BAG-3重要生物学功能之一，其作用为保护细胞抵御重金属[21]、高温[22]及某些药物的刺激，其机制之一是通过介导蛋白的传递过程从而干扰细胞色素c的释放、凋亡小体的组装等过程来调节细胞凋亡[23]。研究表明，在癌症和肌病的发生发展过程中多功能BAG-3蛋白起着决定性的作用[24]，在胰腺癌细胞中BAG-3基因表达水平较高，可能通过Bcl-2和BAG-3的协调作用使细胞发生抗凋亡[25]；在结肠癌细胞中BAG-3基因也呈现高表达，促进细胞存活[26]；在膀胱癌细胞中BAG-3是协同诱导其凋亡的联合治疗的合适靶点[27]；在心肌细胞中BAG-3促进细胞增殖并抑制细胞凋亡[28]。魏莉[29]等报道，BAG-3在子宫颈癌细胞和组织中呈现高表达，从而参调控细胞凋亡。有试验研究指出，BAG-3在红细胞中的表达与TD的发生发展密切相关[30]。本研究结果表明，在诱导TD发生后的第1、2和4天，BAG-3表达量相比健康组低，而在第10、15天BAG-3表达量则较高，说明机体发生TD后会产生一种防御机制来抵抗细胞的非正常性凋亡。试验第1、2、4、10天，D、E和F组BAG-3蛋白的阳性表达是相同的；第6天E组阳性表达量高于D组，而F组与D组表达一致；第15天，E和F组表达情况均高于D组。说明低剂量和高剂量重组GSTA3后期对机体都有轻微的解毒作用。Real-time PCR试验表明，TD发生后，BAG-3基因mRNA表达水平也显著上调；注射GSTA3蛋白后，第2、4、10、15天有显著差异，说明肉鸡TD生长板软骨细胞的凋亡受BAG-3基因调控，而重组GSTA3蛋白可能通过调控BAG-3基因的表达，调节软骨细胞凋亡。

4 结论

重组GSTA3蛋白可能通过调控抗凋亡蛋白3抗凋亡因子的表达，抑制细胞凋亡。在胫骨软骨发育不良损伤修复期，注射GSTA3后使抗凋亡基因抗凋亡蛋白3蛋白表达增强，从而可能参与细胞凋亡来缓解胫骨软骨发育不良损伤，使胫骨软骨发育不良生长板的功能恢复。因此，GSTA3对预防肉鸡胫骨软骨发育不良的发生具有重要的指导意义和很好的临床应用前景。

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Effect of Recombinant GSTA3 Protein on Expression of the Anti-Apoptotic Gene BAG-3 in Thiram-induced Tibial Chondrodysplasia

LI Zhen, YANG ShiXiong, NIU Sheng, ZHANG Ning, LI Xin, ZHANG YangYang, JIA YunFei, TIAN ZhiXiong, NING GuanBao, ZHANG Ding, TIAN WenXia

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

【】 Tibial chondrodysplasia (TD) is a common skeletal disease in broilers. The study was conducted to investigate the effect of recombinant GSTA3 protein on the expression of anti-apoptotic gene BAG-3 in the chondrocytes of broilers induced by thiram, so as to provide a new idea and method for the treatment of TD. 【】120 one-week-old broiler chicks were randomly divided into six groups (A, B, C, D, E and F), in which Group A, B and C were basic diet groups, and group D, E and F were thiram-containing diet groups.TD was induced by thiram for 2 days. After thiram was added for days 1, 3, 5 and 7, recombinant chicken GSTA3 protein and phosphate buffer were injected into the leg muscles. Group A and group D were injected with PBS (100 μg·kg-1); group B and group E were injected with low dose (100 μg·kg-1) GSTA3; group C and group F were injected with high dose (200 μg·kg-1) GSTA3. The experiment lasted 23 days. Tibia growth plates were collected at the 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th and 15th days after thiram treatment. The mRNA level of BAG-3 gene was detected by quantitative PCR, and the protein expression of BAG-3 gene was observed by immunohistochemistry.【】 Real-time PCR results showed that the expression level of BAG-3 mRNA in tibia growth plate of broilers in the thiram-containing diet group was significantly increased, compared with that in the basal diet control group during the repair period of TD injury (＜0.05). Compared with the thiram-containing diet group, E and F groups had significant differences on days 2, 4, 10 and 15, and were significantly lower than that under the thiram-containing diet group on days 10 and 15 (＜0.05), indicating a faster recovery compared with group D. Immunohistochemical results showed that BAG-3 protein was not expressed in the proliferation area and the pre-hypertrophic area of the chicken tibial chondrocytes, but only in the cytoplasm of the hypertrophic area. Compared with the control group A, the expression of BAG-3 protein in the thiram-containing diet group was increased. The recombinant GSTA3 induced the protein expression level in the hypertrophic area in the high and low dose of GSTA3 group compared with the thiram-containing diet group D (days 10 and 15). 【】 In conclusion, GSTA3 recombinant protein could regulate the expression of BAG-3 to participate in the apoptosis pathway and inhibit the apoptosis during the induction of TD in broilers. During the TD-injury repair period, after GSTA3 injection, the expression of anti-apoptotic gene BAG-3 protein was enhanced, which could participate in cell apoptosis to alleviate the TD-injury and make the TD growth plate function of broilers return to normal quickly.

glutathione S-transferase A3 (GSTA3); tibial dyschondroplasia; BAG-3; antiapoptotic; broiler

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.018

2019-05-20；

2019-12-26

国家重点研发计划（2016YFD0500806）、2017年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（201710113001）、2017年山西省高等学校大学生创新创业训练计划项目（2017081）、山西省回国留学人员科研资助项目（2017-073）、晋中市重点科技创新平台（P171002-3）、国家自然科学基金（31072179）、山西省科技攻关项目（20130311027-3）

李桢，E-mail：1091856050@qq.com。通信作者田文霞，E-mail：wenxiatian@126.com

（责任编辑 林鉴非）