基于电子自旋共振和拉曼光谱技术的榛子油氧化特性探析与评价*

崔娜娜 王贵禧 李如华 马庆华 赵天田 梁丽松

(1.中国林业科学研究院林业研究所 国家林业和草原局林木培育重点实验室 北京 100091；2.榛子产业国家创新联盟 北京 100091；3.国家林业和草原局榛子工程技术研究中心 北京 100091；4.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 100091)

榛子(Corylus)为多年生落叶灌木或乔木，与核桃(Jaglansregia)、杏仁(Prunusarmeniaca)、腰果(Anacardiumoccidentala)并称世界“四大坚果”(秦桂珍等，2012)，是我国重要油料树种之一，在我国西南—华中—河南、陇西—秦岭、华北以及东北地区均有分布，遍及25个省(自治区、直辖市)(Yangetal., 2018)。平欧杂种榛(Corylusheterophylla×C.avellana)是以我国平榛为母本、欧洲榛为父本进行远缘杂交获得的新榛种，具有抗寒、大果和丰产的特性，目前我国已选育出40多个平欧杂种榛品种(系)。

榛仁含油量约 60%，以单不饱和脂肪酸为主，其相对含量达 85%以上，是典型的高单不饱和脂肪酸油脂(田文瀚，2012)；同时，榛仁还含有多种抗氧化成分，如类胡萝卜素、生育酚、甾醇等(Alasalvaretal., 2006; Durmazetal., 2019)，在膳食营养和健康中起着重要作用。随着榛子产业快速发展，榛子油作为一种高档食用油，也越来越受消费者青睐。

榛子油不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)含量高，极易发生氧化反应，分解成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物，并产生强烈的“哈败”气味，品质变差甚至失去食用价值(刘印志等，2017)。过氧化值(peroxide value,POV)、p-茴香胺值(p-anisidine value,AV)、总氧化值(total oxidation value,TV)和共轭二烯值等反映油脂氧化程度的常规指标是判断和评价油脂品质优劣的重要方法(于修烛等，2009；Agregetal.，2017)。近年来，电子自旋共振(electron spin resonance,ESR)和拉曼光谱技术广泛用于油脂氧化的检测，其中，ESR是一种新型、灵敏的自由基检测技术，可有效评价油质氧化(Westermannetal., 2009; Chenetal., 2018);拉曼光谱技术灵敏度高，光谱振动带特征峰可显著表征化学基团和分子结构(Zhangetal., 2011)。

目前,国内关于榛子油氧化的研究鲜有报道。研究榛子油氧化过程中的品质变化规律、自由基产生规律以及油脂内部分子结构的变化，揭示榛子油氧化特性，可为榛子油品质及其食用安全性评价提供科学依据，对榛坚果加工利用具有重要意义。鉴于此，本研究对榛子油常规氧化指标、酸和总类胡萝卜素含量的变化进行测定，采用ESR和拉曼光谱技术对榛子油氧化过程中自由基产生、油脂内部化学基团和分子结构变化进行监测，以揭示榛子油氧化规律，同时为ESR和拉曼光谱技术在榛子油品质检测中的应用提供科学支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年9月末，在吉林省吉林市索特科技有限公司榛园采收平欧杂种榛主栽品种‘达维’正常成熟坚果。坚果经自然晾晒至含水率为6.19%，脱壳后得榛仁(除去坏仁)。采用螺旋压榨法，螺旋压榨机加热至100 ℃后，将榛仁置于压榨机中榨取榛子油，收集备用。

1.2 加速氧化试验

取9个培养皿(直径12 cm、高2.3 cm)，分别加入180 g榛子油，随机放在烘箱中。根据Bonoli-Carbognin等(2008)油脂加速氧化试验方法，烘箱温度设为60 ℃，避光。从0天开始，每5天取样1次，每次取出1个培养皿，至40天结束，共9个时间点。取出的榛子油样品置于棕色玻璃瓶中，在-80 ℃冰箱中保存待测。

1.3 测定方法

1.3.1 油脂氧化指标测定 1)过氧化值(POV) 参考GB/T 5538—2005方法。测定3次生物学重复。

2)p-茴香胺值参考GB/T 24304—2009的方法。测定3次生物学重复。

3)总氧化值参考GB/T 24304—2009方法，TV=2×POV+ AV。

4)共轭二烯值 借鉴Agregán等(2017)方法，稍作修改。将榛子油溶于正己烷中，摇匀后于233 nm波长下测定吸光度值，以共轭二烯酸的百分比表示。测定3次生物学重复。

1.3.2 脂肪酸相对含量测定 采用气相色谱法，参照Oliveira等(2008)方法，略有改动。称取油样100 μL加入甲酯化试剂和2 mL乙醚，放置2 h；随后加入蒸馏水，将溶液分层，分离获得有机相备用。取1 mL有机相于进样瓶中，使用气相色谱仪，采用外标面积归一法测定脂肪酸相对含量。测定3次生物学重复。

1.3.3 总类胡萝卜素含量测定 参考PORIM(1995)方法，稍作修改。称取0.5 g油样加入5 mL正己烷溶液，在波长450 nm下测定吸光度，利用β-胡萝卜素(β-carotene)标准品绘制标准曲线。测定3次生物学重复。

1.3.4 自由基相对含量测定 精确配制1 mg·mL-1含PBN(N-叔丁基-α-苯基硝酮)的榛子油样品。采用电子自旋共振波谱仪(JEOL FA-200，日本)设定温度60 ℃，中心磁场322.126 mT，扫宽5 mT，扫描时间4 min。

1.3.5 拉曼光谱测定 采用高分辨率拉曼光谱仪(LabRAM HR Evolution，法国)，选用532 nm激光器，10倍物镜，100%功率，扫描范围100～3 200 cm-1，扫描时间10 s，累加次数1次。

1.4 数据处理

使用SPSS20.0软件进行数据处理，采用Ducan法进行单因素方差分析和相关性分析(P< 0.05)，利用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 榛子油氧化程度评价

油质在不同氧化阶段的氧化产物不同，通常采用多个指标综合评价油质的氧化程度。本研究采用60 ℃烘箱法进行榛子油加速氧化试验，测定榛子油在氧化过程中的POV、AV、TV和共轭二烯值变化其如图1所示。

POV用于判断油脂新鲜程度和质量等级，是在氧化初期衡量油脂氧化程度的重要指标(孙月娥等，2010；Zhangetal.，2010)。由图1A可知，随着氧化时间延长，榛子油不同阶段的POV变化速率不同。在氧化初始阶段(0～5天)，POV变化很小；氧化5～30天期间，POV随氧化时间延长快速增加，并在15天时达42.34 meq·kg-1，超过GB 2716—2018规定的食用油POV(≤19.7 meq·kg-1)上限，品质显著降低，丧失食用价值；氧化40天结束后，POV显著增加至370.47 meq·kg-1，表明榛子油氧化程度急剧升高。

AV用于衡量伴随初级产物生成的二级氧化产物(Poiana, 2012)是油质氧化次级产物的主要检测指标之一，其值越大，表明油脂的氧化劣变越严重。由图1B可知，榛子油AV变化趋势不同于POV。在氧化过程的前25天，AV增加速度缓慢，从初始的0.31增加至1.03，仅增加0.72；氧化25天后，AV开始急剧增加。

TV可全面反映油脂的氧化状态，代表劣变氧化指数(Shahidietal., 2002)。由图1C可知，榛子油TV与POV的变化趋势基本一致。氧化5天，时TV变化不显著，仅比初始值增加3.12；氧化10天时，TV开始急速增加，达44.04；在随后的氧化过程中，TV一直呈快速增加趋势，氧化40天时，TV高达766.85，是初始时(0天)的60.15倍。

共轭二烯是油脂氧化过程中产生的初次氧化产物(weberetal.，2008)，可进一步氧化形成低分子的醛和酮，能够反映油脂过氧化的程度(Halliwelletal., 1993)。由图1D可知，榛子油氧化过程中共轭二烯值呈一直升高的变化趋势，变化范围为0.12～3.48。氧化0～30天期间，共轭二烯值增加趋势较为缓慢，仅升高1.16；氧化35天时，共轭二烯值急剧增加，高达3.46，说明此期间榛子油氧化程度显著升高，品质快速降低。

2.2 脂肪酸相对含量

脂肪酸是油脂的主要成分，油脂氧化劣变从不饱和脂肪酸的氧化开始。由表1可知，榛子油的脂肪酸组成主要为油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、棕榈油酸(C16∶1)、花生酸(C20∶0)和亚麻酸(C18∶3)，其中油酸相对含量最高(83.41%)，其次是亚油酸(9.97%)和棕榈酸(4.40%)。随着氧化时间延长，油酸相对含量逐渐增加，氧化25天后其增加速率明显加快，氧化40天时比初始值增加2.35%；棕榈酸和花生酸相对含量的变化趋势与油酸基本一致，分别增加0.24%和0.03%。亚油酸和亚麻酸因含有多个双键，更容易氧化，其相对含量在整个氧化过程中逐渐降低，分别从9.97%和0.10%降至7.15%和0.05%。棕榈油酸和硬脂酸相对含量保持稳定，没有显著改变。

图1 榛子油加速氧化过程中氧化指标的变化

表1 榛子油脂肪酸主要组成及相对含量①

由图2A可知，在加速氧化的前20天，榛子油不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)相对含量均无显著变化(P> 0.05)；氧化25天时，饱和脂肪酸相对含量降低，而不饱和脂肪酸相对含量增加；在随后的氧化进程中，饱和脂肪酸相对含量逐渐增加，不饱和脂肪酸相对含量逐渐降低。由图2B可知，随着氧化时间延长，单不饱和脂肪酸相对含量呈显著上升的变化趋势，其主要贡献源于油酸相对含量增加，而多不饱和脂肪酸相对含量呈显著降低的变化趋势，主要是因为亚油酸和亚麻酸相对含量减少。

图2 榛子油氧化过程中脂肪酸相对含量变化

2.3 总类胡萝卜素含量

类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，具有抗氧化和免疫调节的功效。由图3可知，榛子油含有丰富的总类胡萝卜素，含量为2.62 μg β-carotene·g-1。氧化5天时，总类胡萝卜素含量显著增加，达2.95 μg β-carotene·g-1，随后则持续降低，至氧化25天时，总类胡萝卜含量降低至1.69 μg β-carotene·g-1；氧化30天时，总类胡萝卜素含量为0。氧化25天时，肉眼可见榛子油颜色变浅，氧化30天时变为无色(图4)，与此时总类胡萝卜素含量结果吻合。

图3 榛子油加速氧化过程中总类胡萝卜素含量的变化

图4 榛子油加速氧化过程中颜色的变化

2.4 自由基变化规律

自由基的产生对促进油脂氧化具有重要作用，本研究利用ESR监测榛子油氧化过程中自由基相对含量的变化。由图5A可知，在60 ℃共振腔放置60 min时，氧化0～15天的榛子油几乎看不到PBN-加合物信号，氧化20天时开始出现微弱的PBN-加合物信号，且随着氧化时间延长，信号也逐渐增强。由图5B可知，随着氧化时间延长，榛子油自由基相对含量不断增加；氧化0～25天自由基相对含量从8.41缓慢增加至12.96，氧化25天后自由基相对含量急剧增加，至氧化40天时自由基相对含量高达28.09，且不同氧化时间的榛子油自由基相对含量之间存在显著差异(P< 0.05)。

图5 榛子油加速氧化过程中自由基的变化

2.5 拉曼光谱变化

图6 榛子油的拉曼光谱及主要特征峰

图7 榛子油加速氧化过程中拉曼光谱和强度的变化

由图7A、B可知，在榛子油氧化过程中，拉曼光谱的一些特征峰强度随着氧化时间延长呈减弱趋势，说明其对应分子基团含量降低。榛子油氧化会改变分子内部结构以及基团之间的相互影响，特征峰位移也会发生微小变化。分析可知，榛子油氧化过程中972、1 080、1 158、1 268、1 524、1 746和3 008 cm-1处的特征峰强度发生了明显变化。其中以2个类胡萝卜素(1 158和1 524 cm-1)、反式脂肪酸(972 cm-1)和顺式双键(1 268 cm-1)特征峰变化最显著。以相对稳定的甲基δ(CH2)特征峰(1 441 cm-1)信号强度为对照，拉曼相对强度I972 cm-1/I1 441 cm-1、I1 268 cm-1/I1 441 cm-1、I1 158 cm-1/I1 441 cm-1和I1 524 cm-1/I1 441 cm-1随着氧化时间的变化如图7D所示。榛子油氧化25天时，I972 cm-1/I1 441 cm-1和I1 268 cm-1/I1 441 cm-1均呈小幅波动升高趋势，分别从0.37和0.55变化至0.40和0.57，但在随后氧化过程中二者的拉曼相对强度均呈快速降低趋势，氧化40天时拉曼相对强度仅为0.30和0.47。I1 158 cm-1/I1 441 cm-1和I1 524 cm-1/I1 441 cm-1的变化趋势保持一致，即在整个氧化过程中拉曼强度快速降低，分别从0.59和0.62降低至0.20和0.15，表明类胡萝卜素基团含量在此期间急剧下降，与总类胡萝卜素含量变化趋势一致。

2.6 氧化过程中各指标的相关性

对氧化过程中各指标的相关性分析(表2)可知，油脂氧化程度评价指标(POV、AV、TV和共轭二烯值)均与饱和脂肪酸相对含量呈极显著正相关(P< 0.01)，与不饱和脂肪酸相对含量和总类胡萝卜素含量呈极显著负相关(P< 0.01)。由此可见，饱和脂肪酸相对含量增加与不饱和脂肪酸相对含量减少是榛子油氧化的重要特征，与POV、AV、TV和共轭二烯值具有显著对应关系，这4个常规氧化指标可很好评价榛子油的氧化程度；总类胡萝卜素含量与榛子油氧化的密切关系使其可以成为判断榛子油氧化程度的重要指示物。

POV、AV、TV和共轭二烯值与自由基相对含量呈极显著正相关(P< 0.01)，与拉曼相对强度(I972 cm-1/I1 441 cm-1、I1 268 cm-1/I1 441 cm-1、I1 158 cm-1/I1 441 cm-1和I1 524 cm-1/I1 441 cm-1)呈极显著负相关(P< 0.01)，自由基相对含量和拉曼光谱特征峰强度可以很好地表征榛子油的氧化程度。

自由基相对含量与不饱和脂肪酸相对含量和总类胡萝卜素含量呈极显著负相关(P< 0.01)，与饱和脂肪酸相对含量呈极显著正相关(P< 0.01)。在榛子油氧化过程中，由于自由基的产生，导致不饱和脂肪酸和类胡萝卜素中的不稳定双键被逐渐氧化成相对稳定的单键，不饱和脂肪酸相对含量减少，而饱和脂肪酸相对含量增加，总类胡萝卜素含量降低。

3 讨论

油脂氧化稳定性是评价油脂品质的重要指标，不同油脂具有不同为脂肪酸组成和不同的抗氧化成分，成为影响油脂氧化稳定性的重要因素。学者们已对脂肪酸氧化进行广泛研究(Prattetal., 2003；Sullivanetal., 2011; Yettellaetal., 2012)。本研究发现，榛子油氧化过程中脂肪酸相对含量变化显著，其中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸相对含量逐渐增加，多不饱和脂肪酸相对含量逐渐减少，氧化25天时不饱和脂肪酸相对含量增加可能是多不饱和脂肪酸被氧化相对含量减少所致。类胡萝卜素是重要的脂溶性活性成分，存在于很多植物油脂中，精炼会导致类胡萝卜素损失(Durmazetal.,2019)。油脂氧化过程中类胡萝卜素含量会随之变化，Yi等(2011)研究鱼油/棕榈油混合油中生育酚、生育三烯酚和类胡萝卜素在氧化过程中的交互作用，发现类胡萝卜素含量随着氧化而降低。榛子油内含丰富的类胡萝卜素，本研究发现，总类胡萝卜素含量减少是榛子油颜色变浅的直接原因，可见总类胡萝卜素含量变化可在一定程度上指示榛子油的氧化程度。

表2 榛子油加速氧化过程中各指标的相关性分析①

① *表示在0.05 水平差异显著; **表示在0.01水平差异显著。* means significantly correlated at the 0.05 level; **means significantly correlated at the 0.01 level.

油质氧化的实质是其结构中不饱和脂肪酸的氧化，可通过光氧化、酶促氧化和自动氧化3种途径进行，其中自动氧化为活化的含烯底物(如不饱和脂肪酸)与基态氧在室温下发生非酶自由基链式反应，是食用油脂品质劣变的主要原因(孙月娥等，2010)。自由基链式反应历程可分为链引发、链传递、链终止(Choeetal.,2006)，氧化过程中产生的大多数自由基不稳定，只有通过ESR才可以测定(Jerzykiewiczetal., 2011)。Chen等(2018)探索牛肉脂质氧化过程，结果表明，随着反复冻融次数增加，自由基相对含量增加。本研究发现，随着榛子油加速氧化时间延长，自由基相对含量不断升高，特别是氧化25天时自由基开始快速大量生成，表明榛子油品质快速降低，与常规氧化指标测定结果一致。

油质氧化过程中因不饱和键丢失导致分子内部结构改变，从而引起了特征峰拉曼强度的变化。Lyndgaard等(2012)研究指出，1 080 cm-1处的拉曼强度与油脂不饱和度呈正相关；Berhe等(2016)研究发现，972和1 264 cm-1处的拉曼强度与油脂不饱和度呈正相关(Berheetal., 2016)，但林新月等(2017)研究发现，亚麻籽油和鱼油972 cm-1处的拉曼强度与油脂不饱和度呈负相关，这可能是因为油脂种类不同导致972 cm-1处的特征峰拉曼强度在油质氧化过程中出现不同变化趋势；Sánchez-Alonso等(2012)发现1 746 cm-1处的拉曼强度与油脂不饱和度呈正相关；Li-Chan等(1994)发现3 008 cm-1处的拉曼信号代表油脂中的不饱和酸。本研究发现，榛子油氧化过程中1 080、1 746和3 008 cm-1处的特征峰强度均呈减弱趋势；氧化25天时拉曼相对强度I972 cm-1/I1 441 cm-1和I1 268 cm-1/I1 441 cm-1均出现升高趋势，可能与榛子油高不饱和度有关；氧化30天时拉曼相对强度I1 158 cm-1/I1 441 cm-1、I1 524 cm-1/I1 441 cm-1大幅度降低，且特征峰信号消失，表明榛子油中对应类胡萝卜素基团含量已大量减少甚至消失。

本研究还发现，常规氧化指标POV、AV、TV和共轭二烯值与自由基相对含量和拉曼强度具有极显著相关性，证明电子自旋共振和拉曼光谱技术可用于评价榛子油的氧化程度。

4 结论

榛子油氧化大致分为3个阶段，即初始缓慢氧化阶段(0～10天)、中间快速氧化阶段(10～20天)和后期深度氧化阶段(20天以后)，综合4个常规氧化指标(POV、AV、TV和共轭二烯值)可以很好评价榛子油的氧化程度。拉曼光谱反式脂肪酸(972 cm-1)和顺式双键(1 268 cm-1)特征峰可准确反映榛子油氧化过程中脂肪酸的组成变化；类胡萝卜素是榛子油色泽的主要贡献因子，与榛子油氧化程度密切相关，利用拉曼光谱中类胡萝卜素特征峰强度可直接预测类的总胡萝卜素含量的变化趋势，进而判断榛子油的氧化程度。自由基相对含量、拉曼光谱特征峰强度和总类胡萝卜素含量与常规氧化指标具有极显著相关性，证明电子自旋共振和拉曼光谱技术可用于评价榛子油的氧化程度。电子自旋共振和拉曼光谱技术作为传统油质氧化评价方法的补充或替代具有很大潜力，可为油脂品质快速检测提供新方法。