地下水人工回灌含水介质微生物堵塞试验研究

高宗军，徐海龙，夏 璐

(山东科技大学地球科学与工程学院，山东 青岛 266590)

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，淡水资源利用范围及规模逐年扩大，消耗量日益增加，地下水水位衰减、地面沉降等很多环境地质问题[1-3]相继出现，生态资源的可持续发展和人民生命财产安全受到严重威胁，合理开发利用水资源势在必行。实施人工回灌地下水是解决这些问题的有效措施之一[4-7]。

人工回灌是将回灌水经相应处理后重新回注到含水层，促进地下水的良性循环。然而，大量工程实践表明[4-7]，回灌过程中极易发生含水层堵塞，严重影响回灌工程的顺利实施，甚至迫使回灌井报废。因此，深入开展地下水回灌堵塞研究，对延长回灌井使用寿命、科学可持续的开发利用水资源具有重要的理论价值和实际意义。人工回灌过程中含水层堵塞可分为物理、化学和微生物堵塞3种。国外相关研究者Dillon等[7]对40例回灌井调查统计，其80%回灌井发生堵塞，物理堵塞占70%，化学堵塞占10%，生物堵塞占15%。物理堵塞中最典型的是悬浮物堵塞，在惯性和水力作用下悬浮物被沉淀和截留在表层含水介质中，渗流阻力增大，回灌率降低；硅酸盐垢、碳酸盐垢在化学堵塞现象中普遍存在。Rosnes等[8]将美国NorthSea地热回灌工程的失败归于硫酸盐还原菌的生长及其胞外聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)的积累。Ripley等[6]研究认为，回灌系统的生物堵塞主要发生在含水介质表层，具体入渗范围受含水介质自身岩性特征、生物菌群、回灌水质、外界环境等因素不尽相同，介质渗透性初始迅速降低，随后缓慢下降。Albrechtsen等[9]认为，细菌是生物堵塞发生的主要原因，堵塞发生在微生物自身生命体及代谢产物形成的生物膜，附着和堆积在含水介质上。姜桂华等[10]发现，回灌前期主要是由于生物膜的产生促使含水介质渗透性降低；回灌后期主要是微生物产气造成的生物堵塞。夏璐等[11]在微生物堵塞过程及机理研究过程中发现含水介质呈现非均质性，渗流距离越长生物堵塞程度越低。路莹等[12]建立了生物生长量模型与含水介质渗透性变化的定量关系，可以对生物堵塞进行预测。常见回灌水源中的微生物(主要为细菌)通常具有较强的环境适应力，在回灌过程中菌体自身及其代谢产物附着、堆积于含水介质表面及孔喉处，降低介质有效孔隙度，进而引起含水层堵塞[13]。微生物堵塞作为地下水回灌中重要的堵塞类型之一，研究含水层微生物堵塞现象及机理，解决生物堵塞问题是值得深入探讨的科学问题。

传统的微生物培养技术对模拟微生物生存的空间环境和营养条件存在不足，且大量微生物具有不可培养性，该技术在地下水微生物研究方面受到局限[14]。现代分子生物学技术的诞生推动了环境微生物领域的发展，该技术不依赖传统的实验室培养方法，可以从分子水平上揭示种群的群落特征信息。高通量测序技术(high-through put sequencing technology)是目前应用广泛、提供较全面种群生物学信息的现代分子生物学技术，主要包括扩增子、宏基因组、宏病毒组、宏转录组等测序研究[15]。目前，高通量测序技术在地下水污染调查和预测方面得到广泛应用，但用于探究回灌堵塞过程中造成堵塞的微生物菌群组成结构的研究较少。相关研究如崔丙健等[16]基于高通量测序技术并结合定量PCR方法探讨再生水灌溉辣椒果实与根际细菌群落组成和病原菌分布丰度特征。Kavitha等[17]运用高通量测序技术发现Brevundimouas菌属在硝酸盐还原过程中起重要作用，为地下水中硝酸盐污染提供指示作用。高远等[18]采用高通量测序技术发现再生水回灌后的土壤细菌群落多样性降低，细菌数量和种群结构变化较大，但回灌过程中，是哪些微生物的繁殖造成了含水层的堵塞，其组成与结构如何，需要进一步研究。

为此，本研究选取山东省青岛市大沽河流域下游地下水为研究对象，采用室内一维回灌试验，进行地下水回灌过程中微生物堵塞试验。基于16 SrRNA的高通量测序技术，深入分析微生物群落多样性和结构特征，从分子水平上揭示含水层回灌堵塞过程中微生物群落特征及其演替规律，以期为浅层含水层回灌生物堵塞的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验装置与材料

采用一维柱试验装置(图1)，包括渗流柱、供水箱、出水箱、定水头装置和测压板5部分。渗流柱由2 mm有机玻璃制成，高37 cm，内径6 cm，有效填充高度为18 cm。柱体底部设置布水区，以便均匀出水，布水板与砂样之间铺设细纱布，防止砂样流出堵塞布水板。渗流柱侧壁设置5个测压管，分别距离顶部溢流口10，12，14，16，26 cm，与测压板相连。测压管与柱体连接处铺设细纱布，防止柱内砂样流失堵塞测压管。

图1 回灌试验装置示意图

天然含水介质存在较大非均质性，但局部为均质介质层[13]，本项研究不探讨非均质因素，同时为排除含水介质化学组分引起的化学堵塞，采用100目石英砂(SiO2含量在99%以上)作为供试含水介质砂样。

接种液选用青岛大沽河流域下游的周臣屯水塔处地下水井水源。

渗流试验回灌水在实验室配制，依据地下水营养盐浓度配制，回灌水包括两部分：水源为蒸馏水；营养盐为葡萄糖、氯化铵、磷酸氢二钾，见表1。

表1 现场地下水及回灌水营养盐指标

1.2 试验方法

1.2.1试验运行

渗透系数(K)是含水介质渗透性能的直观表现，以达西定律为理论依据，计算含水介质绝对渗透系数：

(1)

式中：Q——出水流量/(mL·s-1)；

L——任意两测压管高差/cm；

ΔH——对应渗流途径的水头损失/cm；

A——过水断面/cm2。

根据实测的各层绝对渗透系数与初始渗透系数计算相对渗透系数(K′s)：

(2)

式中：K0——初始渗透系数/(cm·s-1)；

Ks——任意时刻渗透系数/(cm·s-1)。

相对渗透系数值越小表明堵塞程度越低，相对渗透系数值越大表明堵塞程度越高。

1.2.2营养盐指标测定

1.2.3胞外聚合物(EPS)测定

本试验采用甲醛-氢氧化钠法进行砂样中细菌代谢产物EPS提取。EPS的化学成分复杂，包括磷脂、核酸、多糖、蛋白质、腐殖质、糖醛酸以及无机成分，其中多糖、蛋白质为EPS主要成分，占总量的70%～80%[19]。本次试验EPS总量定义为多糖和蛋白质总和。多糖含量测定使用苯酚-硫酸法[20]，以50 mg/L葡萄糖作为标准液；蛋白质测定使用考马斯亮蓝法[21]，以50 mg/L牛血清白蛋白作为标准液。

1.2.4MiSeq高通量测序

相对渗透系数为1和0.01的介质砂样进行高通量测序。依次进行DNA抽提、PCR扩增、荧光定量、MiSeq高通量测序等分析。

根据MP的FastDNA SPINTM kit for soil试剂盒进行DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。

采用带有barcode的特异性引物(338F/806R：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16SrRNAV3-V4区进行PCR扩增[14]。PCR扩增条件：变性(95 ℃，3 min)，扩增循环(变性95 ℃，30 s；退火53 ℃，30 s；延伸72 ℃，45 s)，延伸(72 ℃，10 min)；PCR反应体系：5×FastPfu缓冲液(FastPfu Buffer)4 μL，2.5 mmol/LdNTP混合物2 μL，正向引物(Forward Primer)5 μmol/L 0.8 μL，反向引物(Reverse Primer)5 μmol/L 0.8 μL，FastPfu聚合酶(FastPfu Polymerase)0.4 μL，牛血清白蛋白(BSA)0.2 μL，双蒸馏水(ddH2O)11.8 μL。

参照初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)进行检测定量。

测序工作由上海美吉生物公司利用IlluminaMiSeq测序仪的MiseqPE300平台完成测序。

2 结果与讨论

2.1 含水介质相对渗透系数变化特征

历时85 h的室内实验室模拟回灌，分别计算含水介质整体(0～16 cm)、表层(0～2 cm)、中上层(2～4 cm)、中下层(4～6 cm)和底层(6～16 cm)介质的相对渗透系数(K′s)，分析渗流柱堵塞的时空变化规律。

如图2所示，含水介质整体(0～16 cm)渗透系数呈下降趋势，试验结束后，绝对渗透系数降至初始值的0.05，降幅95%，说明回灌过程中出现严重堵塞现象。与此同时不同层位的渗透系数也存在不同程度的降低。其中，表层(0～2 cm)含水介质堵塞最为严重，K′s降至0.01，降幅为99%；中上层(2～4 cm)介质K′s降至0.89，降幅为11%；中下层(4～6 cm)介质K′s降至0.94，降幅为6%；底层(6～16 cm)K′s降至0.80，降幅为20%。由此可知，回灌过程中，含水介质渗透性呈非线性下降趋势，含水介质表层堵塞最为严重，该现象与夏璐等[11]人研究结果一致，说明含水介质渗透性降低主要原因为发生表层介质堵塞。本试验采用蒸馏水配制营养盐，没有添加悬浮颗粒物质，以石英砂减弱水岩作用等化学反应，消除了物理及化学堵塞发生因素，渗透性能降低的原因应当为发生生物堵塞。张晓婉等[5]在人工回灌微生物堵塞过程中发现细菌数量的增加会降低介质的渗透性能；Knowles等[22]提出生物膜的产生会加速介质堵塞的发生；Thullner等[23]研究发现细菌代谢分泌产生胞外聚合物是致使渗透性降低的主要原因。通过以上相关研究可知，本试验生物堵塞发生原因为附着于介质表层的微生物数量、体积、质量的增加，代谢产物的分泌，生物膜的形成及增厚等。

在时间上，含水介质表层(0～2 cm)及介质整体渗透性依次经历稳定波动—快速下降—缓慢下降—趋于稳定4个阶段；中上层(2～4 cm)、中下层(4～6 cm)和底层(6～16 cm)渗透性呈现稳定波动，小幅度下降直至趋于稳定的趋势。以渗透性能降低的主要发生段表层(0～2 cm)介质为例，初始稳定波动期(0～7 h)含水介质K′s降至0.94，降幅为6%；快速下降期(7～12.5 h)介质K′s降至0.23，降幅为71%；缓慢下降期(12.5～35 h)介质K′s降至0.03，降幅为20%；趋于稳定期(35～85 h)介质K′s降至0.01，降幅为2%。研究表明，生物堵塞在回灌后几天开始出现，渗透性在开始的10天内下降最为迅速，其后下降缓慢[6]，与本试验渗透性衰减趋势相符。黄修东等[24]研究发现含水介质粒径越小越易堵塞。因本试验采用100目石英砂，较容易发生堵塞现象，促使堵塞周期缩短，含水介质渗透性在24 h内快速降低。

图2 相对渗透系数时空变化图

2.2 营养盐指标分析

图3 饱水区和出水区营养盐随含水介质堵塞程度变化趋势图

2.3 胞外聚合物

胞外聚合物EPS是微生物在代谢过程中产生的黏附在细胞壁外对外界不良环境具有抵抗力，且在饥饿环境下可以为自身供给能源和碳源的一种有机高分子聚合物[19]。

图4为相对渗透系数为1(接种柱)，0.85，0.65，0.35，0.15，0.01时含水介质表层砂样EPS含量变化趋势图。由图可知，6个样本中多糖含量均高于蛋白质含量；K′s降至0.15时，EPS含量降低，且多糖减少量高于蛋白质减少量。回灌开始营养源增多，微生物进入快速增长阶段后代谢产物增多EPS升高；回灌后期因生物量增多，营养物相对缺乏，细菌进入衰减期内源呼吸阶段致使EPS降解消耗，其EPS中的多糖作为主要碳源被生物自身消耗利用；回灌末期，部分细菌自溶死亡，胞内聚合物溶出变成胞外聚合物导致EPS升高。

图4 EPS含量随含水介质堵塞程度变化趋势图

2.4 MiSeq高通量测序结果分析

2.4.1测序结果及Alpha多样性分析

回灌始、末(含水介质K′s=1和K′s=0.01)两样本共得有效序列82 467条，平均长度417.41 bp；测序深度均一化，按最小样本序列数抽平，每样本有效序列均32 044条；采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列聚类分析[25]，共得1 404个OTUs，丰度最高的OTU占总序列的7.25%。

Alpha多样性指数可反映地下水环境中微生物群落丰度和多样性，包括反映群落丰富度(Richness)的Chao、Sobs、Ace指数；多样性(Diversity)的Shannon、Simpson指数；均匀度(Evenness)的Shannoneven、Simpsoneven指数和覆盖度Coverage指数。由表2可知，本次测序样本的覆盖度Coverage指数均在0.99以上，说明测序结果能较好地反映样本的真实情况。Richness指数值越高，群落丰度越高。Diversity指数体现细菌群落多样性水平，Shannon值越大，群落多样性越高；Simpson值越小，群落多样性越高[13]。随着回灌进行，含水介质细菌的群落丰富度、多样性及均匀度均呈现降低现象。这可能是在回灌过程中，回灌水的注入扰乱了原本含水介质环境，致使一些自身敏感性较强环境适应性较差的微生物衰亡。

表2 Alpha多样性指数表

2.4.2物种组成与丰度分析

图5为K′s=1和0.01时两样本中微生物在门、属水平上的群落组成及相对丰度图。样本共包括26个细菌门类，65个菌纲类，162个菌目类，258个菌科类，425个菌属类，767个菌种类，相对丰度小于0.01合并为其他(Others)。

在门分类水平上，两样本均以变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门。图5(a)显示，回灌结束后(K′s=0.01)变性菌门(Proteobacteria)，浮霉菌门(Planctomycetes)，蓝细菌门(Cyanobacteria)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，衣原体(Chlamydiae)丰度增加；放线菌门(Actinobacteria)，酸杆菌门(Acidobacteria)，疣微菌门(Verrucomicrobia)，厚壁菌门(Firmicutes)丰度降低；芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、己科河菌门(Rokubacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)基本消失。研究发现，变形菌门在好氧和厌氧环境下均可存活，且在碳、氮、磷循环中起重要作用[26]；浮霉菌门有专性厌氧菌和专性好氧菌[27]，随着回灌进行，含水介质表层生物膜厚度增加，介质表层处于缺氧状态，利于厌氧菌存活；蓝细菌门属厌氧菌易于培养，具有较高耐受性和生长率[28]，比其他菌种更具竞争力；放线菌门[29]需氧代谢，菌体的发育和扩张在缺氧状态受抑制；异养菌所属的绿弯菌门在与其他菌体竞争的过程中处于劣势。

在属分类水平上，回灌始末砂样表层细菌菌属存在较大差异。图5(b)显示，回灌末期，酸杆菌门下的RB41，norank_o_Subgroup_7，norank_c_Subgroup_6，疣微菌门下的Candidatus_Udaeobacter，放线菌门下的unclassified_f_Micromonosporaceae，norank_f_67-14，红色杆菌属(Rubrobacter)，norank_o_Gaiellales，norank_o_IMCC26256，Gaiella，芽单胞菌门下的norank_f_Gemmatimonadaceae，厚壁菌门下的微小杆菌属(Exiguobacterium)，绿弯菌门下的norank_c_KD4-96等菌属相对丰度均降至0.001%以下。红色杆菌属(Rubrobacter)，Gaiella，Dongia均属于专性好氧菌属。变形菌门下的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)，norank_f_Diplorickettsiaceae，军团菌属(Legionella)，Reyranella，食酸菌属(Acidovorax)，Sphingobium，Candidatus_Ovatusbacter，浮霉菌门下的Singulisphaera，蓝细菌门下的norank_o_Chloroplast以及拟杆菌门下的鞘脂菌属Ferruginibacter等菌属丰度均增加，增长幅度达90%以上。慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)能够利用糖类和有机酸[30]。侯志伟等[31]人用可降解聚合物聚已内脂(PCL)和聚羟基丁酸戊酸酯(PHBV)为有机碳源进行反硝化处理脱氮研究中发现食酸菌属为生物膜中优势菌属，可降解BDP及进行反硝化作用。根据WHO《饮用水水质准则》军团菌属(Legionella)被划定为致病性潜在人类病菌[32]。

图5 样本在门分类和属分类水平上物种组成及丰度图

3 结论

(1)地下水回灌过程中，含水介质渗透性呈现明显的非线性降低趋势，除了物理及化学堵塞以外，可发生严重的微生物堵塞。空间上，渗流路径增加堵塞减缓，微生物堵塞主要发生于含水介质表层。时间上，各层介质渗透性依次经历稳定波动—快速下降—缓慢下降—趋于稳定四个阶段。

(3)随回灌进行，EPS含量增多，其中多糖含量高于蛋白质含量；K′s=0.15时微生物进入内源呼吸阶段，EPS含量降低，且多糖减少量高于蛋白质减少量。

(4)含水介质附着细菌主要分布于26个门，65个纲，162个目，258个科，425个属，767个种；细菌群落丰度、多样性及均匀度均呈现下降现象。样本种群均以变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门，假单胞菌属(Pseudomonas)为主要优势菌属；含水介质上附着细菌群落结构发生明显演替，兼性厌氧细菌增多，好氧细菌减少。