响应面法优化西藏金耳多糖提取工艺研究

张家晨，秦良云，刘怡，贾福晨，刘振东，薛蓓

（西藏农牧学院，西藏林芝860000）

金耳（Tremella aurantialba），俗称脑耳，隶属于担子菌亚门，银耳目、银耳科、银耳属，主要分布于中国云贵高原、四川、湖北、山西、江西、福建、西藏等地，西藏虽然含有丰富的野生金耳，但由于地理原因，很少被开发利用[1]。金耳作为一种营养食品，不仅含有丰富的氨基酸、矿物质、活性多糖、维生素和蛋白质，而且还含有特殊的抗癌活性物质[2]。据研究，金耳干品含蛋白质7.5%～9.5%，脂肪1.7～2.9%，碳水化合物66.9%，含糖量 14.38%，纤维 2.6%，灰分 3.44～3.5%[3-5]，并含有对人体重要的微量元素，如硒和锗等。因此被人们当作一种重要的天然保健品和稀有的珍贵药食用真菌[6-7]。传统中药和现代医学研究表明：金耳具有化痰止咳、定喘调气、滋阴润肺、治虚劳、肺结核等的作用[8]，提高造血机能，治疗心脑血管疾病和保护肝脏，能提高机体免疫力[9]。

金耳中重要的功能成分——金耳多糖的开发具有极高的开发利用价值。目前，金耳多糖[10-11]控制血糖，预防和治疗糖尿病及其并发症、高血脂、高血压以及抗肿瘤等功能已经开始被部分学者所研究，随着对金耳多糖功能的进一步了解，金耳的食用、药用价值将会被更好的发现和利用[12]。在《本草纲目》中，李时珍曾对金耳有过这样的评价：“其金黄色者可致癖饮积聚，腹痛金疮”，历来被认为具有重要的医疗、保健价值，被视为“补益身心”、“转弱为强”、“延年益寿”的补品[13]。随着国内学者对金耳的关注度越来越高，在生产技术和基础研究方面取得的一定进展[14]，金耳的食药用价值将会在食品工业中具有重要价值。

水提醇沉法是目前比较受欢迎的一种方法[15]，其方法相对简易、成本较低、操作过程成熟可靠，且一般不会导致提取过程中多糖的降解等变化，故本次试验采取水提醇沉法对林芝金耳多糖进行浸提。预试验采取料液比、浸提温度、浸提时间、浸提次数和醇沉时间5个因素来探究这些因素对金耳多糖提取率的影响，发现浸提次数与醇沉时间对金耳提取的影响并不是很大，所以本试验采用料液比、浸提温度和浸提时间3个单因素，以此对林芝金耳多糖进行浸提[16-18]，探究林芝金耳多糖的提取工艺的条件，并运用响应面法进行优化，旨在为林芝金耳多糖的生产技术和基础研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

金耳：于西藏林芝地区，经西藏农牧学院食品科学工程实验室粉碎，过100目筛后备用。葡萄糖：西陇化工股份有限公司；丙酮、无水乙醇、浓硫酸、苯酚（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

BSA124S型电子天平：北京楚齐仪表有限公司；HH-1数显恒温水浴锅：北京海天友诚科技有限公司；RE52CS旋转蒸发仪：河南兄弟仪器设备有限公司；UV-2102PCS紫外分光光度计：上海恒磁电子科技有限公司；TD5A台式低速离心机：上海重逢科学仪器有限公司；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：广州沪瑞明仪器有限公司；KC-100A数码超声波清洗机：深圳市洁汇超声洗净设备有限公司；UPH-II-10L超纯水机：济南顾驰生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 金耳多糖的提取工艺路线

金耳→烘干→磨粉→称取粉末→单因素试验→响应面法优化工艺→多糖浸提液→乙醇沉淀→检测多糖含量。

1.2.2 多糖得率的计算

1.2.3 金耳多糖含量的测定

对金耳多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法。具体操作方法详见参考文献[19-20]。

1.2.4 热水浸提林芝金耳多糖的单因素试验

1.2.4.1 料液比对多糖提取率的影响

精确称取2.000 g干燥的林芝金耳粉末，设定浸提时间为 3 h，浸提温度为 60℃，选取 1∶20、1 ∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）的料液比对林芝金耳进行浸提，考察不同料液比对林芝金耳多糖提取率的影响。

1.2.4.2 浸提温度对多糖提取率的影响

精确称取2.000 g干燥的林芝金耳粉末，设定料液比为 1 ∶40（g/mL），浸提时间为 3 h，选取 40、50、60、70、80℃为提取温度，对林芝金耳进行浸提，考察不同浸提温度对林芝金耳多糖提取率的影响。

1.2.4.3 浸提时间对多糖提取率的影响

精确称取2.000 g干燥的林芝金耳粉末，设定料液比为 1∶40（g/mL），浸提温度为 60 ℃，选取 1、2、3、4、5 h为浸提时间，对林芝金耳进行浸提，考察不同浸提时间对林芝金耳多糖提取率的影响。

1.2.5 Box-Behnken响应面试验设计

根据Box-Behnken响应面设计原理，结合单因素试验，选取料液比（X1）、浸提温度（X2）、浸提时间（X3）这3个因素，采用三因素三水平的Box-Behnken法进行试验设计，试验自变量因素及水平编码如表1。

表1 Box-Behnken方案设计的因素及水平Table 1 Factors and levels of box-behnken scheme design

1.3 数据处理

本试验采用Design Expert 8.0软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对提取率的影响

料液比对提取率的变化关系见图1。

图1 料液比对提取率的变化关系Fig.1 Relationship between the ratio of solid to liquid and the extraction rate

从图1可以看出，随着料液比的增加，在1∶20（g/mL）～1∶40（g/mL）的范围内，曲线呈现上升状态，表明多糖的提取率在此范围内随着料液比的增加而增加，在1 ∶40（g/mL）～1∶60（g/mL）范围内，曲线呈现下降状态，表明多糖的提取率在此范围内随着料液比的增加而降低。其他条件一定，料液比为1∶40（g/mL）的时候，曲线出现峰值，多糖的提取率达到最大。

2.1.2 浸提温度对提取率的影响

浸提温度对提取率的变化关系见图2。

图2 浸提温度对提取率的变化关系Fig.2 Relationship between extraction temperature and extraction rate

从图2中的曲线表明，随着浸提温度的增加，在40℃～60℃范围内，曲线呈现上升状态，表明多糖的提取率在此范围内随着浸提温度的增加而增加，在60℃～80℃范围内，曲线呈现下降状态，表明多糖的提取率在此范围内随着浸提温度的增加而降低。其他条件一定，浸提温度为60℃的时候，多糖的提取率达到最大。

2.1.3 浸提时间对提取率的影响

浸提时间对提取率的变化关系见图3。

图3 浸提时间对提取率的变化关系Fig.3 Relationship between extraction time and extraction rate

从图3可以看出，随着浸提时间的增加，在1 h～3 h范围内，曲线呈现上升状态，表明多糖的提取率在此范围内随着浸提时间的增加而增加，在3 h～5 h范围内，曲线呈现下降状态，表明多糖的提取率在此范围内随着浸提时间的增加而降低。其他条件一定，浸提时间为3 h的时候，多糖的提取率达到最大。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验分析

在单因素结果的基础上，设计综合优化试验表1，分别设置自变量为料液比X1、浸提温度X2、浸提时间X3，响应值Y为所得提取率，响应面设计为三因素三水平，结果如表2。

表2 试验设计及结果Table 2 Test design and results

2.2.2 建模与显著性考察

基于本次试验所得数据，以金耳多糖的提取率为Y值，对自变量编码的X1（料液比）、X2（浸提温度）、X3（浸提时间）进行回归分析并建立模型，得到以下回归方程：

为了验证回归模型与因素的显著性，将试验数据运用软件Design-Expert 8.0进行方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，方差分析结果如表3。

表3 方差分析表Table 3 Anova table

由表3可知，该试验的模型P＜0.01，表明本试验模型的回归方程的显著性检验结果是可靠的。其次，失拟项P＞0.05，表明失拟项并未显著影响试验结果。极差R2的值为87.09%＞85%，说明该模型有着良好的拟合程度且试验较为准确，数据无严重误差。并且从下表中还可以看出X1（料液比）、X2（浸提温度）、X3（浸提时间）对多糖提取率的影响程度依次为X1＞X3＞X2，除此之外，从 X1X2、X12、X22、X32的 P 值可以认为，它们极显著地影响多糖提取率；而X1、X3的P值介于0.01与0.05之间，可以认为它们显著地影响多糖提取率。综合以上的分析，结果说明各个试验因素与响应值之间有着较为复杂的关系。

2.2.3 响应面法分析各因素间交互作用

图4～图6中反映的是料液比、浸提温度、浸提时间的交互效应之间的关系。

图4 料液比（X1）和浸提温度（X2）交互作用的影响Fig.4 Effects of feed-liquid ratio（X1）and extraction temperature（X2）interaction

图5 料液比（X1）浸提时间（X3）交互作用对的影响Fig.5 Effects of feed-liquid ratio（X1）and extraction time（X3）interaction

图6 浸提温度（X2）浸提时间（X3）交互作用的影响Fig.6 Effects of extraction temperature（X2）and extraction time（X3）interaction

图4反映出料液比（X1）和浸提温度（X2）的交互效应对林芝金耳多糖的提取率具有较为明显的影响，在后续试验中，可以同时适当的调整料液比和浸提温度，以期提高金耳多糖的提取率。并且从图4的平面等高线可以看出，X1方向上曲线的坡度变化较X2方向上曲线的坡度大，说明在料液比（X1）和浸提温度（X2）的交互效应中，料液比（X1）对金耳多糖的提取率影响更大。

由图5可知，X1方向上曲线的坡度变化较X3方向上曲线的坡度大，说明在料液比（X1）和浸提时间（X3）的交互效应中，料液比（X1）对金耳多糖的提取率影响更大。

由图6可知，X2和X3方向上的曲线近似一个圆形，说明浸提温度（X2）和浸提时间（X3）的交互效应对对金耳多糖提取率的影响并不明显。

2.2.4 优化工艺验证试验结果

为获得最佳的提取工艺，继续采用Design-Expert 8.0对上述模型进行进一步分析，所得结果如下：料液比1∶40.6（g/mL），浸提温度 59.78℃，浸提时间 3.09 h。预测金耳多糖的最大提取率是8.020 08%。考虑到试验的可操作性和可行性，选取料液比1∶41（g/mL），浸提温度60℃，浸提时间3 h，测得金耳多糖的提取率为7.9%（进行了3次重复试验），此提取率与模型预测的金耳多糖最大的提取率8.020%，相比较结果相符合。说明用响应面来优化林芝金耳多糖的工艺条件是具有实际操作性的。

3 结论与讨论

本次试验为探究浸提温度、浸提时间、料液比3个因素以及两两因素间交互效应对林芝金耳多糖提取率的影响，采用响应面法优化研究得出了最优的提取条件：料液比1∶41（g/mL），浸提温度60℃，浸提时间3 h，并且在此工艺条件下进行3次验证试验，得出的金耳多糖的提取率为7.9%，该结果与模型预测的结果8.020%大致符合，表明利用响应面法优化金耳多糖热水浸提的工艺条件是具有实际操作性的。在上述试验结果的基础上，响应面分析的试验结果还表明：试验选取的各因素（料液比、浸提时间、浸提温度）对多糖提取率的影响大小从大到小依次为料液比＞浸提时间＞浸提温度。且在交互效应对金耳多糖提取率的影响中，料液比与浸提温度的交互效应对金耳多糖提取率的影响最大。此外，本次试验只探究了上述3个因素与林芝金耳多糖提取率变化关系，部分相关工艺如醇沉、浸提，或所用溶剂浓度也会影响试验结果，所以未来研究者为得出最佳的热水浸提工艺，可以进一步探究上述因素对林芝金耳多糖提取的影响，为林芝金耳多糖的生产技术和基础性研究提供了一定的理论依据。