植物乳杆菌发酵牛乳的研究进展

江远智，石阳阳，严利文，李瑞，赵建新，陈卫，张灏，杭锋

（1.江南大学食品学院，江苏无锡，214122；2.江南大学（扬州）食品生物技术研究所，江苏扬州，225004）

0 引言

随着人们生活水平的提高，人们对于食品的要求也越来越高，不仅要求营养而且还需具备一定的功能。益生菌作为活的微生物，当在人体肠道中达到一定数量，会对人体的健康有益[1]，可以调节肠道微生物菌群的平衡，增强人体免疫力，治疗胃肠道疾病等功能[2]，添加到食品中，可以在补充营养的过程中预防或治疗各种疾病，即体现了食品的营养价值又赋予其特殊的功能。而且随着益生菌研究领域的不断深入，更多的益生菌被筛选出来，益生菌的理化特性和功能被研究的更为透彻，为益生菌在产品中的应用打下了良好的基础。牛乳含有丰富的营养物质，可以为微生物提供丰富的碳源、氮源和生长因子，由于蛋白质含量丰富，可以起到很好的缓冲作用[3]，为微生物生长提供了良好的环境，贮存期间还可以保持高的活菌数。以牛乳作为益生菌的载体[4]，基本可以满足世界上绝大部分人对益生菌的需求[5]。乳酸菌是能将碳水化合物发酵成乳酸的低G+C革兰氏阳性细菌的统称[6]，植物乳杆菌属于乳酸菌属，具有功能多和产酸能力强等特点，作为乳制品的功能菌株具良好的应用前景。开发乳酸菌菌株作为酸奶功能菌株已经成为国内外研究的热点，而国内的研究起步比较晚，国内酸奶发酵剂主要依靠国外进口，因此，开发具有自我知识产权的具有发酵和益生功能的菌株非常重要。

1 植物乳杆菌研究进展

1.1 植物乳杆菌的功能

植物乳杆菌具有较强的耐酸和耐胆盐的能力[7-9]，较强的耐酸能力由于具有精氨酸脱亚胺酶（ADI）调节系统、苹果酸-乳酸发酵（MLF）途径[10]和碱性休克蛋白[11]，以及酸性条件下具有修复或保护受损的DNA和蛋白质调节机制[12]；较强的耐胆盐能力由于菌株胞外多糖、表面蛋白和应激相关蛋白[11]，以及菌株对胆盐的转化能力[13]。

选择益生菌的一项重要标准是细菌粘附在人体胃肠道（GIT）上皮细胞的能力[14]，而益生菌在肠道中的粘附和随后的定居是由位于细胞壁外表面的黏附素介导的，黏附素是蛋白质，通过与GIT粘液层的相互作用或与细胞外基质蛋白（如纤维粘连蛋白、胶原和层粘连蛋白）的相互作用[15]。细菌黏附是一个复杂的过程，首先黏附素蛋白与受体之间发生非特异性物理相互作用，然后黏附素蛋白与其受体之间发生特定的相互作用。不能黏附在肠壁上的菌株，通过胃肠道到达小肠，其停留时间也只有数小时。植物乳杆菌对固定的胶原蛋白具有很强的黏附力[16]，Ashok等人[17]的研究表明，植物乳杆菌对ECM蛋白具有很高的结合能力。大部分植物乳杆菌与人体肠道细胞通过生化作用发生特异性粘附[17-18]，使植物乳杆菌粘附在人体肠道表面的能力强于致病菌，减少了致病菌的黏附，使致病菌不能在人体肠道中长时间停留，肠道中致病菌数量下降[19]，益生菌数量上升，因此，致病菌对人体的危害减轻，使人体患各种肠道疾病的风险降低[20]，也使益生菌在肠道中停留时间延长，有助于益生菌发挥其功能。植物乳杆菌通过提高血清中的IgA、IgG、IgM水平，促进免疫细胞的增殖，刺激活性氧、溶酶体酶和单核因子分泌，可以提高机体的免疫能力[21-22]。植物乳杆菌还具有减除有害因子的能力，如吸附重金属铅[23]、镉[24]和铝[25]，清除塑化剂[26]，清除全氟化合物，清除展青霉素[21,27]。通过将胆固醇插入、同化和黏附在益生菌细胞膜表面[28]，促进胆固醇与胆汁反应、转运以及胆汁释放过程[29]，使血浆中胆固醇水平降低[30]。植物乳杆菌还具有调节代谢、精神和神经等功能。

1.2 植物乳杆菌应用

至2018年10月，完成全基因组测序并提交至美国国立生物技术中心的植物乳杆菌菌株有67株，基因组草图304株[21]。植物乳杆菌是公认的具有益生功能的菌株[31]，具有高水平的表型和基因多样性[32]，能够占据各种生态位[33]，作为人体肠道常见共生菌。具有抑制肠道有害菌和致病菌的生长、降低胆固醇、清除有害因子、调节免疫功能、调节代谢紊乱、调节精神和神经功能以及调节酒精性和非酒精性脂肪肝，而且具有较强的耐酸、耐胆盐和耐渗透压能力，从摄食到小肠发挥功能，能保持高的存活率。植物乳杆菌作为优良的益生菌种，被广泛应用于发酵食品，作为乳制品、泡菜、肉类的发酵剂，还被添加到药品、膳食补充剂、糖果零食、口腔护理、日化用品等产品中，发酵液或菌体作为畜禽饲料，增强畜禽的免疫力。作为拥有广阔市场的乳制品，成为益生菌进入人体的有效途径。

2 植物乳杆菌发酵牛乳中氮源的吸收利用

2.1 酪蛋白的水解

乳酸菌的生长需要外界提供氨基酸和多肽，酪蛋白的水解产物可以为乳酸菌在牛乳中生长提供必须的营养物质，以及产生多种生物活性肽，使发酵乳具有好的风味和口感[34]。乳酸乳球菌水解酪蛋白如图1[35]，酪蛋白被细胞壁蛋白酶水解为寡肽、三肽和二肽[35]，通过Opp、Dpp、Dtp转运系统将多肽转运到胞内，在胞内肽酶作用下，被水解为游离氨基酸。胞内肽酶主要有x-脯氨酸二肽基氨基肽酶（PepX）、三肽酶（Pep T）、脯氨酸酶（PepQ）、脯氨酸亚胺肽酶（PepI）、二肽酶（PepD和PepV）、氨肽酶、羧肽酶和内肽酶，负责将寡肽水解为游离的氨基酸。转录调节因子Cod Y负性调节乳中蛋白水解酶系统的几个组成部分的表达，抑制强度与异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸有关[35]，当营养物质丰富时，游离氨基酸和寡肽较多，蛋白水解酶系统被抑制。由于乳酸菌生长环境中的营养物质非常丰富，可以从环境中摄取游离氨基酸及营养物质，使糖代谢、摄取、发酵和氨基酸合成相关基因衰退[36-37]，导致大多数乳酸菌不能有效水解牛乳中的酪蛋白，以及缺乏肽转运系统，因此，部分乳酸菌在游离氨基酸和寡肽丰富的环境中生长旺盛，在牛乳中生长缓慢或不生长。

图1 酪蛋白水解图

2.2 肽转运系统

大部分乳酸菌为氨基酸营养缺陷型，牛乳中游离氨基酸含量低，需要从外界吸取自身生长繁殖所需的必须氨基酸，部分乳酸菌具有细胞壁蛋白酶，可以将乳蛋白水解为小分子肽，而肽酶位于细胞内，乳蛋白的水解产物由Opp、Dpp、Dtp系统转运到胞内被肽酶水解为菌株生长繁殖所需的氨基酸，Opp主要转运寡肽，也可以转运多肽，Dpp和Dtp主要转运二肽和三肽，部分乳酸菌也具有Opt运载体[38]，可以协同Opp运载体共同完成多肽的转运，在Opp缺乏的乳酸菌中Opt起主要运载作用。拥有Opp和Opt运载体的菌株能更好的吸收多肽，在与其它菌株的竞争占有更大的优势[39]。

Opp由OppA、OppB、OppC、OppD和OppF五个亚基组成，可以运输4～35个氨基酸残基，从5肽到9肽，肽与OppA的结合能力显著升高，9肽的结合能力最强，5肽结合能力差，但不影响5肽的运输[40]。受体和底物结合蛋白OppA通过N-末端脂质锚锚定于膜上，具有开放和闭合构象，不同的构象对肽的亲和力不一样。OppA在开放的状态下暴露出与溶液中特定氨基酸的作用位点，使多肽与Opp A结合，肽与受体蛋白通过氢键和静电相互作用力结合，Detmers[40]通过将缓激肽1～9位点的的氨基酸用其它氨基酸替代，当4、5和6位点的氨基酸被替代，缓激肽与OppA的结合能力显著降低，说明肽链中4、5和6位点的氨基酸的亲和力强于其它位点的氨基酸，其N和C末端与Opp A的结合更具有弹性，与多肽的序列无关[41]。疏水氨基酸更利于结合，而甘氨酸、脯氨酸和负电荷残基降低了结合亲和力。Helinck[42]通过固相萃取将酪蛋白衍生肽分离为酸性、碱性和中性部分，酸性和碱性肽存在可以降低YGGFL转运率，而中性肽对YGGFL转运没有影响，因此，酪蛋白衍生肽中只有阳离子和阴离子起竞争作用，可以抑制目标肽的转运。两个同源整合膜蛋白Opp B和Opp C，它们一起形成易位孔，两个同源核苷酸结合域Opp D和Opp F，通过ATP结合和水解促进肽转运。

肽转运系统成为乳酸菌在牛乳中增殖的瓶颈，存在细胞壁蛋白酶的乳酸菌同样需要肽转运系统，在游离氨基酸和寡肽丰富的环境中，乳酸菌可以通过Opp、Dpp、Dtp将肽转运到胞内，而在游离氨基酸和寡肽含量较低的环境中，肽转运系统和蛋白水解酶成为乳酸菌在其中生长不可或缺的两个组成部分，蛋白水解酶将大分子蛋白质水解为寡肽和游离的氨基酸，肽转运系统将其转运到胞内供细菌生长繁殖。

2.3 氨基酸缺陷对植物乳杆菌在牛乳中生长和增殖的影响

对于乳酸菌而言，牛乳中的碳源和氮源的比例影响其代谢产物，当氮源不足时，氨基酸、蛋白质、DNA和RNA的合成受到影响，牛乳中的活菌数难以提高，人饮用后难以起到益生作用，限制了该菌株在牛乳中的使用，当碳源不足时，会影响胞内的糖和脂类代谢过程，影响细胞的产能和产酸。

基因组测序和比较基因组杂交揭示了植物乳杆菌基因组的高度多样性和灵活性以及代谢的多样性[43]，具有磷酸转移酶（PTS）和糖转运系统酶类的相关基因[11]，包含EMP途径和磷酸乙酮醇酶的编码基因[44]，糖利用的基因盒如图2[43]，其中含有25个完整的（PTS）糖转运系统和完善的丙酮酸盐代谢系统，能将胞外单糖和寡糖转运到胞内，适合在含各种糖源的环境中生长，在良好的生长环境中，植物乳杆菌代谢产酸能力强。

植物乳杆菌基因通常以大簇和操纵子形式存在，自身可以合成除缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸外的全部氨基酸[44]，因此，植物乳杆菌不能在缺乏缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸基质中生长。牛乳中寡肽和游离的氨基酸含量低[45]，而且植物乳杆菌缺乏PrtP基因[44]，不能合成细胞壁蛋白酶，使酪蛋白水解的第一步很难完成，由于没有专门运载酪蛋白的运载体，氨基酸不能通过水解酪蛋白和多肽得到及时的补充，氨基酸必须以其它代谢的中间代谢产物为原料合成，降低了氨基酸的产生速率，导致胞内一些重要酶的合成受到影响，影响了胞内DNA、RNA、脂质和糖的合成，导致植物乳杆菌在牛乳中生长缓慢。

图2 糖利用基因盒

3 促进植物乳杆菌在牛乳中增殖方法

大多数乳酸菌蛋白水解能力弱，对营养要求苛刻，需要在营养丰富的环境中生长，在牛乳中生长缓慢，需要补充乳酸菌可以利用的有机氮源[46]。植物乳杆菌缺乏细胞壁蛋白酶[47]，乳蛋白在胞外不易被水解[48]，可以直接被植物乳杆菌生长繁殖利用的乳蛋白的水解产物少，导致植物乳杆菌生长繁殖的底物需要重新合成或必须氨基酸缺失，植物乳杆菌在牛乳中生长缓慢或不生长。植物乳杆菌胞内含有多种肽酶，可以水解胞内的寡肽为其生长代谢提供必须的氨基酸，可以通过添加各种含寡肽的食品级配料，通过寡肽转运蛋白Opp、Dpp、Dtp转运系统将寡肽和氨基酸运输到胞内，寡肽在胞内肽酶作用下被水解，补充生长所需的必须氨基酸，使植物乳杆菌可以在牛乳中增殖。实验室和工业生产通过添加增殖剂和协同发酵改善植物乳杆菌在牛乳中的生长情况。

3.1 添加增殖剂

国内外研究做了在牛乳中添加氨基酸、核苷酸、矿物质、维生素、果蔬汁和酪蛋白水解产物等增殖剂，使植物乳杆菌在牛乳中增殖。Ma等人实验证明异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和核苷酸前体物质为植物乳杆菌在牛乳中增殖的必须成分[49]，其中一种氨基酸的缺乏会影响植物乳杆菌在牛乳中的生长速率和活菌总数。Yang等[50]人研究表明，添加10% 的黑莓汁可以使植物乳杆菌在中牛乳中活菌数达到1×1010cfu/g，黑莓汁的添加还可以抑制致病菌的生长。Gilles[46]在牛乳中添加酪蛋白的水解产物促进植物乳杆菌增殖，可以使活菌数达到1×109cfu/g，添加量为1% 时，既可以起到好的促进作用，随着添加量的增加，活菌数并没有呈线性增加，可见酪蛋白水解产物中含有植物乳杆菌在牛乳中生长的限制因子。Saguir[51]实验表明二肽比游离的氨基酸更适合作为植物乳杆菌生长繁殖的氮源，二肽和游离氨基酸都可以促进植物乳杆菌的增殖，但添加二肽的促进效果比添加游离氨基酸好，并且活菌数高。国内研究做了在牛乳中添加酵母提取物、酪蛋白酶解物、蛋白胨等作为增殖剂，可以使植物乳杆菌在牛乳中活菌数达到1×109cfu/g[52]。通过添加增殖剂，可以使植物乳杆菌在牛乳中达到较高的活菌数，因此，在工业生产中可以添加促进植物乳杆菌在牛乳中增殖的食品级配料，即可以丰富酸奶的种类，也可促进植物乳杆菌的生长。

3.2 协同发酵

植物乳杆菌水解酪蛋白的能力较弱，瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌等其它乳酸菌具有酪蛋白水解能力，可以借助水解酪蛋白能力强的乳酸菌水解酪蛋白作为植物乳杆菌的底物，促进植物乳杆菌在牛乳中生长。Gilles[46]实验表明，酪蛋白水解产物可以被植物乳杆菌利用，可以选择合适的乳酸菌与植物乳杆菌共同作为牛乳的发酵菌株，促进植物乳杆菌在牛乳中生长。协同发酵过程中菌株可以相互交换代谢物和信号分子提高菌株在环境中的适应能力[53]，产生更多的代谢产物和生物活性物质。两株或多株菌作为牛乳的发酵菌株可以产生更多的芳香型化合物[53]，还可以增加酸奶的益生功能。Cemile[54]研究表明，S.thermophilus RSKK 04082、L.delbrueckii subsp.bulgaricus DSM 20081和L.plantarum RSKK 02030单独作为牛乳的发酵菌株，产酸能力都不强，相同培养条件下，协同发酵产酸更快和总活菌数更高。植物乳杆菌单独在牛乳中生长的能力差，在储藏期间活菌数保持极佳的稳定性，Sarn[55]研究证明植物乳杆菌可以在嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵牛乳中生长，预培养的植物乳杆菌（4.5% NaCl，p H 4.5或6.5）会显著降低发酵乳中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌活菌数，缓解了发酵乳的后酸化，而总活菌数也保持在较高水平。与植物乳杆菌协同发酵，可以增加酸奶在储藏期间的稳定性使新鲜生产的酸奶中自发脱水作用相对降低，在冷藏阶段后期，酸奶样品中的蛋白水解相对增加[56]。

4 结束语

通过对植物乳杆菌基因组学和蛋白质组学的研究，完成了部分菌株的全基因组测序和蛋白质组图，可以从基因和蛋白质层面更深入了解植物乳杆菌代谢机制，更加清晰的阐明植物乳杆菌的理化特征和生理功能。植物乳杆菌具有较强的耐酸、耐胆盐和耐渗透压的能力，可以提高菌株在胃肠道中的存活率，具有很好的益生特性。植物乳杆菌由于缺乏PrtP基因，不能合成细胞壁蛋白酶，不能水解牛乳中的乳蛋白，胞内多肽和氨基酸等氮源得不到及时的补充，只能由自身合成，影响了DNA、RNA和蛋白质的合成，导致植物乳杆菌在牛乳中生长缓慢或不生长，限制了其在工业上的大规模应用，近来的研究，通过在牛乳中添加寡肽含量丰富的食品及配料和协同发酵等方法可以使植物乳杆菌在牛乳中增殖，说明植物乳杆菌拥有肽转运系统，在肽和氨基酸含量丰富的环境中可以很好的生长，同时，以牛乳作为植物乳杆菌的传递途径，将会使植物乳杆菌拥有广阔的市场，基于植物乳杆菌的益生功能，将来还会开发新的增殖剂和协同发酵菌株，也可以丰富酸奶的种类。