HOTTIP在口腔鳞癌中的表达及意义

宋洪宁　雷印涛　邢在臣　刘敏

【摘要】 目的 探討口腔鳞状细胞癌（OSCC， 简称鳞癌）中HOXA远端转录本（HOTTIP）的表达及意义。方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测HOTTIP在正常人口腔黏膜角质形成细胞（HOK）和人OSCC细胞系（HSC-4）中的表达情况;对HSC-4细胞转染HOTTIP-inhibitor， qRT-PCR检测转染后HOTTIP的表达量， MTT实验、细胞划痕实验检测转染后对HSC-4细胞增殖、迁移的影响。结果 通过qRT-PCR检测HOTTIP的表达量， HSC-4细胞中的HOTTIP表达量（1.521±0.117）显著高于HOK细胞的（1.060±0.036）， 差异有统计学意义（P<0.05）;对HSC-4细胞转染HOTTIP-inhibitor， qRT-PCR检测HSC-4细胞转染后HOTTIP的表达量， HOTTIP-inhibitor组HOTTIP的表达量（0.336±0.070）均明显低于Control组和Inhibitor-NC组的（1.062±0.092）、（1.023±0.103）， 差异均有统计学意义（P<0.05）;MTT实验证实HSC-4细胞转染HOTTIP-inhibitor后， HOTTIP-inhibitor组相对于Control组和Inhibitor-NC组， 细胞增殖能力明显下降， 差异有统计学意义（P<0.05）， 提示敲低HOTTIP的表达能显著降低HSC-4细胞的增殖能力;细胞划痕实验中， HOTTIP-inhibitor组细胞的划痕愈合速度减慢， HOTTIP-inhibitor组转染后24 h细胞划痕占比（53.27±1.85）均大于Control组和Inhibitor-NC组的（21.10±0.78）、（25.13±1.69）， 差异均具有统计学意义（P<0.05）， 提示HOTTIP的低表达能有效地降低细胞迁移能力。

结论 与HOK细胞相比， HSC-4细胞中HOTTIP表达明显上调， 敲低HOTTIP的表达能显著降低HSC-4细胞的增殖能力、迁移能力， 证实其在OSCC中发挥促癌作用。

【关键词】 口腔鳞癌;HOXA远端转录本;肿瘤标志物

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.13.085

Expression and significance of HOTTIP in oral squamous cell carcinoma   SONG Hong-ning， LEI Yin-tao， XING Zai-chen， et al. Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Second Affiliated Hospital of Shandong First Medical University， Taian 271000， China

【Abstract】 Objective   To discuss the expression and significance of HOXA transcript at the distal tip （HOTTIP） in oral squamous cell carcinoma （OSCC）. Methods   Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to detect the expression of HOTTIP in normal human oral keratinocytes （HOK） and human OSCC cell line （HSC-4）. The expression of HOTTIP after transfection was detected by qRT-PCR， and the effects of transfection on proliferation and migration of HSC-4 cells were detected by MTT assay and cell scratch assay. Results   The expression of HOTTIP was detected by qRT-PCR. The expression of HOTTIP in HSC-4 cells （1.521±0.117） was significantly higher than  （1.060±0.036） in HOK cells， and the difference was statistically significant （P<0.05）. HSC-4 cells were transfected with HOTTIP-inhibitor. QRT-PCR was used to detect the expression of HOTTIP in HSC-4 cells. The expression of HOTTIP in the HOTTIP-inhibitor group （0.336±0.070） was significantly lower than （1.062±0.092） and （1.023±0.103） in the Control group and Inhibitor-NC group， their differences were statistically significant （P<0.05）. MTT experiments confirmed that after HSC-4 cells were transfected with HOTTIP-inhibitor， the cell proliferation ability of HOTTIP-inhibitor group was significantly lower than that of Control group and Inhibitor-NC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）， suggesting that the expression of HOTTIP can significantly reduce the proliferation ability of HSC-4 cells. In the cell scratch test， the scratch healing speed of the cells in the HOTTIP-inhibitor group was slowed down. The percentage of cell scratches （53.27±1.85） in the HOTTIP-inhibitor group at 24 h after transfection was greater than （21.10.±0.78） and （25.13±1.69） in the Control group and Inhibitor-NC group， and the differences were statistically significant （P<0.05）， suggesting that the low expression of HOTTIP can effectively reduce the cell migration ability. Conclusion   Compared with HOK cells， the expression of HOTTIP in HSC-4 cells was significantly up-regulated. Knocking down the expression of HOTTIP can significantly reduce the proliferation and migration of HSC-4 cells， confirming that it plays a pro-cancer role in OSCC.

【Key words】 Oal squamous cell carcinoma; HOXA transcript at the distal tip; Tumor markers

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）在口腔颌面部恶性肿瘤中占比高达80%以上， 每年约有50万新增病例， OSCC易发生淋巴结转移， 晚期可发生远处转移， 经治疗后， 患者5年生存率只有50%～60%[1]， 预后较差， 肿瘤的局部复发和远处转移特性是治疗失败的最重要因素[2]， 其发病机制尚未阐明。因此， 探索与OSCC发生、发展和预后相关的生物学标记物显得十分重要。近年来许多研究证实[3， 4]，

在许多恶性肿瘤中， 都会存在一个共同现象即长链非编码RNA（long non-coding RNA， lncRNA）的异常表达， 其与肿瘤的发生发展关系密切， HOXA远端转录本（HOXA transcript at the distal tip， HOTTIP）属于lncRNA的一种， 研究发现其在多种恶性肿瘤中的表达同样具有差异性， 并通过影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡、转移等参与肿瘤的形成和发展[5-7]。但关于其在OSCC中的表达情况的研究甚少， 本研究采用qRT-PCR方法检测HOTTIP在HOK和HSC-4细胞中的表达情况， 并研究敲低HOTTIP对HSC-4细胞增殖及迁移的影响， 以期为OSCC的诊断及分子治疗提供重要的参考。

1 材料与方法

1. 1 试剂与仪器 HOK和HSC-4细胞获自American Type Culture Collection（ATCC， Manassas， VA， 美国）， 胎牛血清（FBS）及RPMI1640培养基均购自美国GIBCO公司， Lipofectamine TM 2000、TRIzol購自美国Invitrogen公司， RNA逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒、RNA酶抑制剂、dNTPs SYBR Mastermix均购于大连TaKaRa公司。HOTTIP引物、GAPDH引物均购自Sigma公司。MTT购自美国sigma公司。HOTTIP-inhibitor和Inhibitor-NC购自RiboBio （中国广州）。主要仪器：细胞培养箱购自美国Thermo公司， Prism 7000型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司， Elx800型全自动酶标仪购自美国Bio Tek公司， 生物分光光度仪购于美国Thermo公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 细胞培养 用含10%FBS的RPMI1640培养基培养细胞， 置于37℃、含5%二氧化碳（CO2）及饱和湿度培养箱中培养。每隔2～3 d换液， 待其达70%～80%融合度时， 可进行后续转染实验。

1. 2. 2 qRT-PCR检测HOK和HSC-4细胞中HOTTIP的表达量 参照说明书进行qRT-PCR检测HOK细胞和HSC-4细胞中的HOTTIP水平。由上海生工生物工程有限公司设计并合成HOTTIP及内参GAPDH的引物。引物序列：HOTTIP上游：5-CCTAAAGCCACGCTTCTTTG-3， 下游：5-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3;GAPDH上游：5-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3， 下游：5-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3。逆转录按照Prime-Script TM逆转录试剂盒说明书逆转录成互补脱氧核糖核酸（cDNA）， 反应条件：30℃ 10 min， 60℃ 30 min， -80℃保存备用。实时荧光定量PCR按照SYBR Green说明书配制反应体系。取cDNA进行qRT-PCR， 定量PCR条件如下：95℃ 30 min预变性， 然后进行40个循环：95℃ 10 s， 60℃ 20 s， 然后70℃延伸10 s。每个样品3管重复。根据绘制的标准曲线得到HOTTIP基因以及内参基因GAPDH的相对表达量， 采用2-△△CT计算方法进行统计分析。

1. 2. 3 细胞转染 将指数生长的HSC-4细胞在含有10%FBS的RPMI1640培养基中培养24 h， 然后用HOTTIP-inhibitor， Inhibitor-NC转染。根据制造商的方案使用Lipofectamine?2000试剂（Invitrogen?）转染。用HOTTIP-inhibitor转染后的细胞被认为是HOTTIP-inhibitor组;用Inhibitor-NC转染后的细胞被认为是Inhibitor-NC组;未经任何处理的细胞被认为是Control组。转染48 h后， 使用qRT-PCR进行检测。

1. 2. 4 MTT检测 采用MTT法检测敲低HOTTIP水平对HSC-4细胞增殖的影响。将对数生长期细胞以1×105个接种于96孔板中， 分别于转染24、48、72、96 h后， 加入5 μg/μl预先配好的MTT溶液20 μl， 孵育4 h后加入二甲基亚砜（DMSO）（150 μl/孔）， 在450 nm波长下检测各组的吸光度（A值）。以Control组为参考， 计算其余各组A值与Control组的比值以此计为增殖率。实验重复3次。

1. 2. 5 细胞划痕实验 将转染的HSC-4细胞接种在24孔板中24 h， 然后通过使用10 μl移液管机械伤害细胞并用磷酸缓冲盐溶液（PBS）除去碎片。再孵育48 h后， 洗涤孔以除去培养基， 并使用倒置显微镜以100X视图捕获代表性图片。使用Image-Pro Plus 6.0记录和分析伤口区域。实验重复≥3次。该测定在转染后48 h进行。

1. 3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 qRT-PCR检测HOTTIP的表达量 通过qRT-PCR检测HOTTIP的表达量， 采用2-△△CT计算方法进行统计， 分析结果显示HSC-4细胞中的HOTTIP表达量（1.521±0.117）显著高于HOK细胞的（1.060±0.036）， 差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2. 2 HOTTIP-inhibitor转染及qRT-PCR检测转染后HOTTIP的表达量 对HSC-4细胞转染HOTTIP-inhibitor， qRT-PCR检测转染HOTTIP-inhibitor后HOTTIP的表达量， 结果显示， HOTTIP-inhibitor组HOTTIP表达量（0.336±0.070）均明显低于Control组的（1.062±0.092）和Inhibitor-NC组的（1.023±0.103）， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2. 3 MTT检测 对HSC-4细胞转染HOTTIP-inhibitor， MTT实验证实HSC-4转染HOTTIP-inhibitor后， HOTTIP-inhibitor组相对于Control组和Inhibitor-NC组， 细胞增殖能力明显下降， 差异具有统计学意义（P<0.05）， 提示敲低HOTTIP的表达能显著降低HSC-4细胞的增殖能力。见图3。

2. 4 细胞划痕实验 细胞划痕实验中， HOTTIP-inhibitor组细胞的划痕愈合速度减慢， HOTTIP-inhibitor组转染后24 h细胞划痕占比（53.27±1.85）均大于Control组的（21.10±0.78）和Inhibitor-NC组的（25.13±1.69）， 差异均具有统计学意义（P<0.05）， 提示HOTTIP的低表达能有效地降低细胞迁移能力。见图4， 图5。

3 讨论

起初， lncRNA被认为是基因组转录的“噪音”， 不具有任何生物学功能， 随着研究的逐渐深入， 发现其实lncRNA在疾病学、细胞学等领域是极其具备医学价值的。现在科学家已经研究出来的lncRNA基因的数量已经达到了5万左右。越来越多的实践以及实验发现， 在各大肿瘤的产生、转移、发展期间都离不开lncRNAs[8]。其中与肿瘤相关的lncRNA主要有H19、肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1， MALAT-1）、同源异型框基因反义基因间RNA（homeobox antisense intergenic RNA， HOTAIR）、前列腺癌抗原3（prostate cancer antigen 3， PCA3）等。HOTTIP作为lncRNA的一类， 其首次被發现是在人体末梢的成纤维细胞[9]， 其位于7号染色体短臂1区5号带2亚带， 即7p 15.2， 其所发生的转录其 实是在HOXA13的5 ′端上游300个碱基处， 经5′ 端剪 切成熟后将RNA输送至胞质内，其所形成的非编码RNA，核苷酸分子长度为3764个。HOTTIP的重要作用是对机体细胞的新陈代谢进行有效调控， 主要是通过影响Wnt/β-catenin、Bax/Bcl-2等的信号传导来实现， 当然， 对核染色质发挥修饰作用也是其具有的功能之一， 譬如较为常见的赖氨酸甲基转移酶就可以通过调控来实现对相关基因表达的掌控[9]。

HOTTIP得到了科学家们的广泛关注， 其可在肝癌、结肠癌等众多恶性肿瘤中表现出一定的特异性变化， Quagliata等[10]就对HOTTIP与HOXA13进行了具体的分析， 发现它们在患者体内的含量和患者肝癌病变程度有着密切联系， 呈现正比状态;Gu等[11]对患有食管癌的患者进行研究， 尤其是对鳞状细胞癌患者分析， 发现HOTTIP出现异常的患者生命受损比普通患者更为严重， 其生存机会比普通患者要少;Li等[12]与其团队针对胰腺导管癌和慢性胰腺炎展开研究， 运用基因芯片对患者进行比对证明了患者体内HOTTIP出现的显著异常， 将癌细胞与周边细胞间进行对比发现癌细胞所含HOTTIP成分明显优于周边细胞;Ye等[13]在对胃癌患者进行剖析时， 也发现了相似的状况， 相关癌细胞内含有的HOTTIP量均高于其他组织， 且关系着患者病情、肿瘤的尺寸及出现死亡的几率。目前， HOTTIP是如何参与恶性肿瘤的进展尚不清楚， 其具体作用机制尚未明确， 但无疑其表达量增加是促进肿瘤发生、发展的重要因素之一。

本实验通过分析， 发现HSC-4细胞中的HOTTIP表达量显著高于HOK细胞， 这也意味着在OSCC患者病情发展过程中， HOTTIP起着一定的促进作用。本次实验尚存在一些不足之处， 如缺少对其具体机制的研究， 后期的研究中将进一步通过细胞实验探讨HOTTIP的具体作用机制。

综上所述， HOTTIP在口腔鳞癌治疗过程中有着一定的指导意义， 可有效帮助实现对患者病情的掌控。

参考文献

[1] Parkin DM， Bray F， Ferlay J， et al. Global cancer statistics， 2002. CA Cancer J Clin， 2005， 55（2）：74-108.

[2] Petti S， Masood M， Scully C. The magnitude of tobacco smoking-betel quid chewing-alcohol drinking interaction effect on oral cancer in South-East Asia. A meta-analysis of observational studies. PLoS One， 2013， 8（11）：e78999.