LMP/TAP基因多态性与甲状腺癌易感的相关性研究

蒋洁　王丹妹　牛海艳　蔡仁桑　谭蓉　黄用豪

【摘要】 目的 为探讨低相对分子质量蛋白酶体（LMP）和抗原处理相关载体（TAP）基因单核苷酸多态性（SNP）与甲状腺癌易感性的关系， 为我国人类基因组多样性的研究提供理论依据。方法 124例甲状腺癌患者设为病例组， 另选取111例健康人群设为对照组， 采用聚合酶链式反应（PCR）酶切片段长度多态性（RFLP）对LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中研究最多的四个多态性位点片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）进行检测， 并对其易感性进行分析。结果 遗传多态性分析和单倍型联合分析结果均表明， 四种多态性位点与甲状腺癌的发生无显著相关性（P>0.05）。结论 说明选择分析的Codon60/Codon145/Codon333/Codon637这四种多态性位点片段与甲状腺癌的发生可能不存在关联性。

【关键词】 低相对分子质量蛋白酶体;抗原处理相关载体;基因单核苷酸多态性;甲状腺癌

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.13.041

低分子量蛋白酶体（Low Molecular Proteasome， LMP）和抗原处理相关运载体（Transporter associated with Antigen Processing， TAP）基因单核苷酸多态性与微生物感染和一系列免疫相关性疾病的发生有着密切关联[1， 2]， 但目前国内外的研究尚未有与甲状腺癌感染的易感性关联的报道， 为此本研究选取LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中四个多态性位点片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）， 对海南省疾病预防控制中心收集的124例甲状腺癌患者进行了SNP位点的检测， 并对其进行了易感性的关联分析。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 纳入2017年6月～2019年6月收治的124例甲状腺癌患者设为病例组， 另选取同期体检的111例健康人群设为对照组。病例组男28例， 女96例;年龄21～69岁， 平均年龄（44.9±12.0）岁。对照组男51例， 女60例;年龄21～71岁， 平均年龄（45.1±12.4）岁。对照组为在海南居住与病例组无直接血缘关系的健康人群， 经病史询问以及常规体格检查确定健康状况良好， 无长期用药史， 无癌症病史。本研究经海南省疾病预防控制中心机构审查委员会批准， 获得书面知情同意。所有研究对象均由海南省疾病预防控制中心协助采集静脉血。病例组和对照组的人口统计学特征见表1。

1. 2 方法

1. 2. 1 提取基因組DNA 每例研究对象抽取静脉血

2 ml， 使用全血DNA快速提取试剂盒（亚能生物）， 按照试剂盒操作说明操作。

1. 2. 2 基因多态性分析 提取基因组DNA后， 利用引物对LMP基因和TAP基因的多态性进行基因分型。采用采用PCR-RFLP技术对上述四种多态性进行检测。反应在50 μl反应混合物进行， 包括基因组DNA 4 μl， 10×PCR缓冲液5 μl， dNTPs（2.5 mM）4 μl， 每个特定引物2 μl， Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.5 μl和ddH2O 32.5 μl。PCR反应条件：94℃预变性3 min， 然后94℃变性30 s，

57℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 共35个循环， 最后在72℃延伸3 min（所有试剂均为Takara公司。PCR仪SureCycler8800为美国AGILENT公司）。扩增后的产物经纯化后， 取PCR产物10 μl（DNA约1 μg）， 在不同的条件下， 根据制造商的说明， 使用特定的限制性内切酶消化。消化后的片段在2.5%琼脂糖凝胶中电泳， 溴化乙锭染色。通过对所有多态位点的病例和对照组的随机DNA样本（n=10）进行直接测序， 确定基因分型的准确性。最后， 利用Phase1.0软件构建四种基因多态性的单倍型。

1. 3 观察指标 观察分析PCR及酶切结果、Hardy-Weinberg平衡检验结果、单倍型与甲状腺癌的相关性、 基因型、等位基因频率和性别特异性相关分析、遗传多态性与甲状腺癌的相关性。

1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件处理数据。采用χ2检验验证病例组与对照组之间基因型频数是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。多态性与甲状腺癌症之间的相关性以比值比（OR）及其95%置信区间（95%CI）表示， OR值及其95%CI以无条件逻辑回归模型分析， 均经年龄、性别等混杂因素校正， P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 PCR及酶切结果 本研究选择了4个非同义编码SNP。利用RFLP方法， 根据酶片段数目的不同， 确定基因型（纯合子和杂合子）。LMP2扩增产物经HhaI酶切后可观察到3种不同的基因型：367 bp的多态纯和型（Leu/Leu）， 208 bp和159 bp两条区带的野生纯和型（Arg/Arg）;208 bp、159 bp和367 bp三条区带的杂合型（Arg/Leu）。LMP7扩增产物经BsmI酶切后可观察到3种不同的基因型：351 bp的多态纯和型（Lys/Lys）， 148 bp和203 bp两条区带的野生纯和型（Gln/Gln）;148 bp、203 bp和351 bp三条区带的杂合型（Lys/Gln）。TAP1-1扩增产物经Bcl-1酶切后可观察到3种不同的基因型：430 bp的多态纯和型（Val/Val）， 155 bp和275 bp两条区带的野生纯和型（Ile/Ile）;155 bp、275 bp和430 bp三条区带的杂合型（Val/Ile）。TAP1-2扩增产物经Acc I酶切后可观察到3种不同的基因型：357 bp的多态纯和型（Gly/Gly）， 94 bp和263 bp两条区带的野生纯和型（Asp/Asp）;94 bp、263 bp和357 bp三条区带的杂合型（Gly/Asp）。见表2。

2. 2 Hardy-Weinberg平衡檢验 通过对病例组和对照组人群中4个多态位点的基因型数据进行统计分析， 结果表明其等位基因频数的分布没有显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

2. 3 遗传多态性与甲状腺癌的相关性 4种多态性位点（LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2）的等位基因和基因型频率在病例组和对照组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。LMP7 AA纯合子的基因型频率高于对照组， OR值5.3 [95%CI（0.5， 52.9）]， 但由于具有该基因型的样本数太少而不具有统计意义。见表3。

2. 4 基因型、等位基因频率和性别特异性相关分析

考虑到病例组和对照组在性别分布上的差异， 通过将男性和女性分开来进一步分析数据。当样本按性别分层时， 得到的结果与上述结果类似， 虽然LMP7在男性组中比较P<0.05， 但由于样本数量的限制， 认为其不具有统计学意义。其余多态性位点（LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2）的等位基因和基因型频率在甲状腺癌患者和对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2. 5 单倍型与甲状腺癌的相关性 基于遗传学的研究， 单个SNP的存在对于复杂性疾病的发生、发展未必是一个个分散性的作用， 相互之间可能存在一定的内在关联和相互作用。为了研究LMP/TAP基因中四个多态位点的联合作用， 进行了单倍型联合分析共有6种单倍体组合， 纯和单倍体型出现的频率相对较低， 而纯合子单倍体型可能会增加单倍型频率估计的不准确性， 从而导致错误的推断， 因而统计将-/Haplotype和Haplotype/Haplotype合并， 并评估了整体单倍型分布于甲状腺癌的关系。结果显示， 甲状腺癌与选取的LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中四个多态性位点片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）可能不存在关联性。见表5， 表6。

3 讨论

甲状腺癌的发病原因及机制至今仍未阐明， 一般认为在多基因遗传的背景下， 由自身免疫紊乱所介导， 在感染、精神因素等环境因素作用下发病， 遗传因素在发病机制中起重要作用[3]。有研究表明：甲状腺癌的发生发展与某些基因及其基因的多态性有关[4， 5]， 如RET原癌基因、TSHR基因、BARF基因和RAS 基因等。近年来有研究显示HLA-DQA1、DQB1是甲状腺癌的易感基因， 但并不能完全解释甲状腺癌复杂的遗传背景[5， 6]。自从发现LMP、TAP在内源性抗原的处理、提呈中所起的关键作用以来， 已可见有关文献报道毒性弥漫性甲状腺肿（GD）患者淋巴细胞内的mRNA量减少且与其表面表面HLA-Ⅰ类抗原表达减少程度平行;应用双色-间接免疫荧光技术观察， 发现LMP2、LMP7过高表达且与HLA-Ⅰ类抗原、TAP1过高平行[6， 7]。这两项研究所得出不同结论或可用组织取材、人群差异等因素解释， 但在肯定LMP、TAP在GD发病中充当一定角色这一方面是一致的， 同时亦提示LMP、TAP基因多态性所致的细胞表面HLA-Ⅰ类抗原过低或过高表达， 使胚胎时期产生对自身抗原免疫耐受的缺失或自身免疫倾向而触发了GD。为此本选择研究了LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中研究最多的四个多态性位点片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）。

基于遗传学的研究， 单个SNP的存在对于复杂性疾病的发生、发展未必是一个个分散性的作用， 相互之间可能存在一定的内在关联和相互作用， 而单倍型则是这种遗传相互作用与关联的体现， 所以对于单倍型的研究则能够揭示多个LMPs和TAPs与疾病的易感关联[8， 9]。但的研究结果表明LMP/TAP基因多态性与甲状腺癌无显著关联性[10]。本研究收集了124例甲状腺癌病例样本， 样本量大小适中， 因此该结果具有一定的可信度。但是SNP基因的多态性有着与种族、民族、个体差异、不同人群的疾病易感性和药物治疗的敏感性以及对环境反应的分子基础、地域分布频率差异性， 因此LMP/TAP基因与甲状腺癌发生发展中的作用还有待进一步研究。

参考文献

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[收稿日期：2020-01-15]