龙胆苦苷对刀豆蛋白A致小鼠肝损伤的保护作用及其机制

郝妍斐,卢永颖,王信林,郭欣茹,江修宇,张潇文,杜 源,张雷明

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005)

肝脏是以代谢功能为主的器官,担负人体的重要生理功能,据统计,我国每年约有38万人死于肝脏疾病,严重危害人类健康[1]．免疫性肝损伤通常由生物性因素等引起,其重要的特征是肝组织内大量的炎细胞浸润,产生免疫/炎症应答,从而导致以免疫反应为基础的肝损伤[2]．现代医学认为,免疫性肝损伤的发病机制与免疫/炎症应答及免疫调节紊乱有关[3]．

研究显示,固有免疫分子NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体作为激活细胞炎症反应的分子装置,在肝脏疾病的发病中发挥启动或促进作用[4-5],提示肝脏NLRP3炎性小体的活化在免疫性肝损伤的发生发展中起着重要作用．Toll样受体4(TLR4)是最早发现的TLR家族的重要成员之一,在天然免疫中发挥着重要作用．NF-κB是广泛存在于哺乳动物细胞中的重要转录调控因子,在诱导炎症因子表达方面起关键性调控作用[6]．TLR4与其配体结合后,可启动经典的NF-κB信号通路,最终引起NF-κB的活化[7]．有文献显示,NF-κB 能够调节由炎症反应、肝免疫功能紊乱诱发的急性肝损伤、肝硬化、肝细胞恶变及肝癌的生长[8]．

龙胆科植物中的环烯醚萜苷类化合物具有肝保护作用[9]．龙胆苦苷(gentiopicroside)是龙胆属植物龙胆的主要药效成分[9],具有保肝、抗炎等作用[10-12],结构式见图1．有文献报道,龙胆苦苷对脓毒症小鼠急性肝损伤具有保护作用[13].然而,龙胆苦苷对免疫性肝损伤的保护作用及其机制尚未见确切报道.基于此,本研究考察了龙胆苦苷对Con A所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用及其机制．

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性BALB/c小鼠(体重20±1 g)60只,SPF级,由济南朋悦动物繁育有限公司提供,动物许可证号SCXK(鲁)2014-0007．所有实验用小鼠均在烟台大学药学院动物房内饲养,室温控制在22±1°C,相对湿度约为40%,动物自由饮水摄食,给予正常昼夜光照．本研究经过烟台大学动物伦理委员会批准,实验方案符合烟台大学动物伦理委员会的规定．

1.1.2 实验仪器与设备 电子天平(瑞士梅特勒-托利多(Mettler Toledo)有限公司);电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);移液器(德国艾本德(Eppendrof)公司);低温离心机(德国艾本德(Eppendrof)公司);全波长扫描酶标仪(美谷分子仪器(Molecular Devices)上海有限公司)．

1.1.3 实验药品与试剂 龙胆苦苷购自南京广润生物技术有限公司(GR-135-180320);联苯双酯滴丸购自万邦德制药公司(A02J180304);刀豆蛋白A购自北京索莱宝科技有限公司;ALT、AST检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所．

1.2 试验方法

1.2.1 实验动物分组 BALB/c小鼠60只,随机分为6组:空白对照组、模型组、联苯双酯100 mg/kg(阳性对照)组、龙胆苦苷25 mg/kg组、龙胆苦苷50 mg/kg组、龙胆苦苷100 mg/kg组,每组10只．

1.2.2 实验造模及给药 参考相关文献,按1.2.1的实验分组灌胃给予相应的溶媒或药物,每天1次,连续7 d．末次给药1 h后尾静脉注射10 mg/kg Con A进行造模,禁食8 h后,小鼠立即安乐死,同时取血清、肝脏、脾脏等进行下述各项检测．

1.3 检测指标

1.3.1 肝组织病理检测 注射Con A 8 h后,每组随机挑选3只小鼠进行心脏灌注．先灌注20 mL生理盐水,再灌注20 mL 4%多聚甲醛组织固定液,取小鼠右叶肝脏,固定于4%多聚甲醛组织固定液中,经过脱水、石蜡包埋、制片、HE染色,光学显微镜观察肝脏病理变化．

1.3.2 肝脏转氨酶活性检测 注射Con A 8 h后,麻醉小鼠并取血,室温下静置半小时,4°C离心15 min(3 500 r/min),吸取上清,按ALT、AST检测试剂盒(微板法)的标准操作流程,检测血清中ALT、AST含量．为消除血清中脂血、溶血的影响,测定时每个样品孔都设定自身对照．

1.3.3 肝、脾指数检测 各组小鼠取血前称重,记录体重．麻醉取血后处死小鼠,剥离肝脏、脾脏,在预冷的生理盐水中漂洗干净,滤纸吸干水分,电子天平称重,计算脏器指数:脏器指数=(脏器质量g/动物质量10 g)×100%.观察肝、脾脏形态变化．

1.3.4 肝组织蛋白表达检测 将肝组织置于裂解缓冲液中进行匀浆以提取蛋白质,匀浆在8 000 r/min,4 ℃的条件下离心30 min,收集上清液．使用BCA法测定蛋白质含量．通过Western blot分别测定肝脏中的NLRP3、TLR4、P65以及p-P65的表达,并用ImageJ/Gel-pro软件进行定量分析．

1.4 统计学处理方法

2 实验结果

2.1 龙胆苦苷对Con A致肝损伤小鼠肝脏病理学的影响

HE染色结果显示,对照组小鼠肝脏细胞排列整齐规则,以中央静脉为中心呈单行放射状分布,细胞结构形态正常．模型组小鼠“肝条索”消失,中央静脉周围大量炎性细胞浸润,肝细胞脂肪变性,坏死．联苯双酯100 mg/kg组小鼠肝细胞结构形态正常,细胞坏死及炎性细胞浸润聚集均显著减少．龙胆苦苷 25 mg/kg剂量组小鼠肝脏较模型组有所好转,龙胆苦苷 50,100 mg/kg剂量组小鼠肝条索状排列趋于正常,细胞坏死、炎性细胞浸润显著减少(图2)．

2.2 龙胆苦苷对Con A致肝损伤小鼠血清ALT、AST含量的影响

取小鼠血清,根据ALT、AST试剂盒的标准操作流程,检测血清中ALT、AST的含量．结果显示,与对照组相比,模型组小鼠血清ALT、AST含量明显升高(P<0.01),与模型组相比,联苯双酯100 mg/kg组显著降低小鼠血清中ALT、AST含量(P<0.05或P<0.01),3个剂量组的龙胆苦苷均能显著降低小鼠血清ALT及AST的含量(P<0.05或P<0.01)(图3)．

2.3 龙胆苦苷对Con A致肝损伤小鼠肝、脾指数的影响

取小鼠肝脏、脾脏并称重,计算肝、脾指数．结果显示,与对照组相比,模型组小鼠肝、脾肿大,肝、脾指数均明显升高(P<0.01);与模型组相比,联苯双酯 100 mg/kg 剂量组显著降低小鼠脾脏指数(P<0.01),龙胆苦苷25、50、100 mg/kg剂量组均能显著降低小鼠肝、脾指数(P<0.01或P<0.05)(图4,图5)．

2.4 龙胆苦苷对Con A致肝损伤小鼠肝组织NL-RP3、TLR4和P65的影响

2.4.1 龙胆苦苷对Con A致肝损伤模型小鼠肝组织NLRP3炎性小体表达的影响 采用Western blot技术,检测小鼠肝脏匀浆中NLRP3的表达．结果显示,与对照组相比,模型组小鼠肝组织NLRP3表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,联苯双酯 100 mg/kg组小鼠肝组织NLRP3表达略有下降但并无显著性差异;与模型组相比,龙胆苦苷 50及100 mg/kg剂量组小鼠肝组织NLRP3表达显著降低(P<0.05)(图6)．

2.4.2 龙胆苦苷对Con A致肝损伤小鼠肝组织TLR4表达的影响 采用Western blot技术,检测小鼠肝脏匀浆中TLR4的表达．结果显示,与对照组相比,模型组小鼠肝组织TLR4表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,联苯双酯 100 mg/kg组小鼠肝组织TLR4表达显著下降;与模型组相比,龙胆苦苷 50及100 mg/kg剂量组小鼠肝组织NLRP3表达显著降低(P<0.05)(图7)．

2.4.3 龙胆苦苷对Con A致肝损伤小鼠肝组织P65蛋白磷酸化的影响 采用Western blot技术,检测小鼠肝脏匀浆中P65和p-P65的表达．结果显示,与对照组相比,模型组小鼠肝组织p-P65/P65表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,龙胆苦苷 25,50,100 mg/kg剂量组小鼠肝组织p-P65/P65表达均显著降低(P<0.01)(图8)．

3 讨 论

肝病的发病与免疫功能密切相关[14]．1992年,TIEGS等[15]成功地应用Con A诱发了小鼠特异性肝损伤,这一实验模型是由T淋巴细胞介导的免疫性肝损伤．Con A是一种植物凝集素,可以刺激T细胞活化,并在肝脏中特异性聚积[16],Con A与肝窦有很好的亲和性,小鼠静脉注射Con A后,T淋巴细胞随循环系统进入肝窦并在局部增殖,释放多种细胞因子进而导致肝损伤,这种诱导方式具有肝脏特异性和靶向性,与自身免疫性肝病和人类病毒性肝炎非常相似[17],因此本研究选用此模型来观察龙胆苦苷对免疫性肝损伤的影响．

目前,临床评价肝损伤的主要指标有ALT和AST[18],生理状态下,ALT、AST主要存在于肝细胞内,血清中这二者的含量很低．当发生肝损伤时,肝细胞破裂死亡,大量的ALT、AST释放入血,导致机体血清中ALT、AST含量大量增加[19]．与此同时,肝组织也发生病理性变化,出现脂肪变性、坏死以及炎细胞浸润．在本研究中,小鼠尾静脉注射Con A后,肝组织结构破坏,血清ALT、AST水平显著升高,肝细胞出现弥漫性坏死,同时伴有淤血和炎细胞浸润,说明造模成功．低、中、高剂量的龙胆苦苷均能显著降低模型动物血清ALT、AST的水平,肝细胞形态结构趋于正常,脂肪病变、坏死以及炎细胞浸润均显著减少．上述结果提示,龙胆苦苷对Con A所致小鼠免疫性肝损伤有一定的保护作用．研究表明,由于炎症作用,肝损伤时常会伴有肝、脾肿大[20]．在本实验中,小鼠腹腔注射Con A 8 h后,肝、脾明显肿胀,而不同剂量的龙胆苦苷均能够显著减轻小鼠肝、脾的肿胀程度,表明龙胆苦苷能对Con A所致的肝损伤起到保护作用．

免疫性肝损伤发病机制可能与游入肝组织的炎症细胞功能状态密切相关[21]．NLRP3炎性小体作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用．有研究显示,NLRP3炎性小体在免疫性肝损伤的发生发展期间具有促炎症反应的关键作用[22]．TLR4是细胞上的跨膜蛋白,广泛存在于T淋巴细胞和B淋巴细胞表面,其参与的信号转导对免疫系统的调节发挥着至关重要的作用[23]．许多植物多糖可作为TLR4配体进而激活TLR4/NF-κB信号通路,活化转录因子NF-κB,调控细胞因子的转录,提升机体的免疫防御能力[24-25]．由此发现NLRP3、TLR4以及NF-κB 信号通路的活化可能是急性肝损伤发生机制中的关键调节点．因此,本研究以上述三者为研究对象,研究了龙胆苦苷的肝损伤保护机制．结果显示,龙胆苦苷可显著抑制NLRP3炎性小体的表达以及TLR4/NF-κB信号通路的活化,进而抑制炎症反应,对肝脏起到保护作用．

本研究初步表明,龙胆苦苷对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤具有明显的保护作用,其作用机制可能是通过抑制NLRP3、TLR4的活化以及降低NF-κB P65的磷酸化来发挥肝保护作用．其中NF-κB P65的磷酸化以及NLRP3炎性小体的表达两者之间的具体调节关系有待进一步研究．

4 结 论

综上所述,龙胆苦苷对Con A致小鼠肝损伤有较好的保护作用;龙胆苦苷可能通过下调NLRP3并降低TLR4、p-P65/P65的表达来抑制机体炎症反应,从而发挥肝保护作用．