肠润方对功能性便秘大鼠结肠Cajal间质细胞及c-kit/SCF信号通路的影响※

●肖秋平 洪燕秋 耿学斯▲ 文 磊

功能性便秘（function constipation，FC）是消化系统常见病、难治病，全球发病率逐渐上升。FC的发生与多种因素相关，但发病机制尚未完全阐明。研究显示，伴有结肠动力障碍的FC患者占相当比例[1]。目前普遍认为Cajal 间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）的异常是导致胃肠道动力障碍性疾病的一个重要原因，ICC 特异性表达的酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（Tyrosine kinase growth factor receptor，c-kit）及其配体干细胞因子（stem cell factor，SCF）结合所启动的信号通路对ICC 生长发育及功能的维持至关重要。中医认为便秘的反复发生主要由于阴血不足，肠道失润，或气虚气滞，推动无力，或两者兼并。基于“运脾滋阴”治法的肠润方在前期临床研究中取得确切疗效[2-3]。本研究旨在探讨肠润方对FC 大鼠结肠ICC 及c-kit/SCF信号系统的影响，揭示滋阴行气法治疗FC、改善结肠动力的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 动物健康SD大鼠72只，雌雄各半，体重（220±20）g，由厦门大学实验动物中心采购提供，许可证号：SYXK(闽)2013-0006。饲料、垫料来源同上，饲养室温度20℃～25℃，湿度45%～55%。

1.2 药物与试剂肠润方（炒白术20g，玄参15g，麦冬15g，火麻仁15g，枳实15g，槟榔15g），肠润方水煎剂：将95g 生药饮片浸泡于蒸馏水中（蒸馏水略没过饮片即可）1h后回流煮沸30min，滤出药液，再加入蒸馏水（蒸馏水略没过饮片即可），同法煮沸30min，过滤。将两次得到的滤液混合，在3500rpm 离心滤液10min，药液旋蒸浓缩至47.5mL，得到200%肠润方水煎液。实验前配制含生药量分别为0.5g/ml、1g/ml 和2g/ml的肠润方水煎液。

麻仁丸：福州海王金象中药制药有限公司（批号：1805042）；复方地芬诺酯：新乡市常乐制药有限公司（批号：17040952）；PBS 磷酸缓冲液（索莱宝公司，批号：P1010）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，批号：P0010S）；PVDF 膜（迈博瑞公司，批号：R7EA3809G）；c-kit 抗体（Thermo Fisher 公司，批号：34-8800）；SCF 抗体（Abcama 公司，批号：ab64677）；IgG抗体（Abcama公司，批号：ab150077），RNA提取试剂盒（Promega 公司，批号：LS1040）；逆转录试剂盒（Promega 公司，批号：A5001）；RT-PCR 试剂（全式金公司，批号：AQ101-03）；免疫组化染色试剂盒（索莱宝公司，批号：SP0041）。

1.3 分组与造模72 只健康SD 大鼠正常喂养和观察1周，随机分为空白组、模型组、麻仁丸组以及肠润方高、中、低剂量组，共6 组，每组12 只。根据课题组前期实验造模方法造模[4]，空白组予蒸馏水2.2 ml/次，2次/天灌胃，模型组、麻仁丸组、肠润方组予复方地芬诺脂10mg/kg/d 灌胃，连续灌胃14 天。各组均于末次给药30min 后以0.2mL/20g 的墨汁灌胃，记录大鼠首粒黑便排出时间、6h 内的排便粒数和大便性状，通过SPSS 22.0 统计软件进行分析，验证便秘模型成功制备。

1.4 药物干预造模成功后，空白组、模型组均予蒸馏水1ml/100g/天，2 次/天灌胃；麻仁丸组予规格为0.6g/粒的麻仁丸按成人（60kg）日服计量2.4g 换算成SD大鼠剂量0.3g/kg/d，2次/d灌胃；肠润方高、中、低剂量组根据《中药药理实验方法学》计算出中药人鼠等效剂量，按成人（60kg）日服剂量95g换算成SD大鼠服用剂量为低剂量组5.5g/kg/d，中剂量组11g/kg/d，高剂量组22g/kg/d，2次/d灌胃，各组连续灌胃14天后进行取材。

1.5 标本采集末次给药结束后，禁食不禁水12h，颈椎脱臼处死动物，打开大鼠腹腔取2cm结肠肠管共2份，1份经生理盐水清洗后用OTC保鲜剂固定，液氮保存待western blot 及RT-PCR 测定，1 份固定于中性福尔马林中，以待免疫组化测定。

1.6 免疫组织化学法检测取放于4%多聚甲醛固定的组织，经脱水、包埋制成连续切片。石蜡切片脱蜡后进行抗原修复。用组化笔画圈围住组织，滴加3%过氧化氢灭活内源酶活性。加山羊血清封闭液封闭非特异性位点，室温10min。甩掉封闭液，圈内滴加一抗（1:1000稀释的兔抗鼠c-kit或1:1000稀释的兔抗鼠SCF）盖住组织，放入湿盒内4℃过夜。二抗（1:3000稀释的羊抗兔IgG）室温孵育10min。链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液在室温下孵育10min，DAB 显色。苏木素复染细胞核，自来水冲洗反蓝，1%盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗三分钟，脱水，中性树胶封片。用Definiens Tissue StudioTM 图象分析系统，测定各组ckit、SCF 阳性细胞的平均光密度值(average optical den-sity，AOD)。

1.7 Western Blot 检测取大鼠结肠组织样品，加入蛋白裂解液混匀，冰上静置10～15min，12000rpm离心10min，取上清液，重复离心，BCA 蛋白测定试剂盒测得待测样品的蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳，转膜，PVDF膜取出置于含5%奶粉的TBST中，室温慢摇封闭1h，一抗（1:1000 稀释的兔抗鼠c-kit 或1:1000稀释的兔抗鼠SCF）放置低速摇床上4℃过夜。TBST漂洗3次，10min/次，室温孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（1:3000 稀释的羊抗兔IgG）低速孵育1h，TBST漂洗3次，10min/次。ECL工作液浸润PVDF膜，避光显影，Tubulin作为内参照。

1.8 RT-PCR 检测取液氮冻存新鲜结肠组织，提取总RNA，测定RNA 浓度，RNA 电泳测定其完整性。经promega 反转录试剂盒操作，所得cDNA 进行RTPCR 检测。反应体系共10μL。经ABI Primer Express10 软件设计荧光定量PCR 引物，由大连宝生物工程有限公司合成。各检测指标引物序列见表1。热循环参数如下：95℃30s 为第一阶段，1 个循环；95℃5s，60℃30s 为第二阶段，45 个循环。以β-actin基因为内参照。CFX96Manager软件分析结果。

表1 c-kit、SCF、β-actin引物序列

1.9 统计学方法数据采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理。数据以均数±标准差（）表示，组间比较若满足正态性且方差齐时采用单因素方差分析LSD法和SNK法，若方差不齐，采用DunnettT3法进行方差检验和两两比较，若数据非正态分布采用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 便秘模型建立情况实验过程中，无大鼠死亡，表明复方地芬诺酯法制备FC 模型具有安全性、稳定性。模型组、麻仁丸组及肠润方高中低各剂量组在大鼠首粒黑便排出时间、6h内粪便排出颗粒数量以及粪便重量与空白组比较均有统计学差异（P＜0.05），表明FC大鼠模型成功复制。见表2。

表2 6组大鼠排便情况比较（）

表2 6组大鼠排便情况比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.05

2.2 免疫组化检测大鼠结肠组织中c-kit、SCF 的分布与表达c-kit、SCF均分布于结肠组织和间隙。从c-kit的表达情况分析，结果显示：与空白组比较，模型组和肠润方低剂量组的c-kit表达量均显著降低（P＜0.01或P＜0.05），肠润方高剂量组和中剂量组与空白组比较无显著差异（P＞0.05），而麻仁丸组的c-kit表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，麻仁丸组、肠润方高剂量组和中剂量组的c-kit 表达量均显著升高（P＜0.01或P＜0.05），而肠润方低剂量组与模型组比较无显著差异（P＞0.05）。其中，肠润方高、中、低剂量组的c-kit表达量呈逐渐下降的趋势。见图1。

图1 免疫组化检测各组大鼠结肠中c-kit分布与表达情况（SP×400）

从SCF 的表达情况分析，结果显示：与空白组比较，模型组和肠润方中剂量组和低剂量组的SCF表达量均显著降低（P＜0.001 或P＜0.01），而麻仁丸组和肠润方高剂量组与空白组比较无显著差异（P＞0.05）；与模型组比较，麻仁丸组、肠润方高剂量组和中剂量组的SCF表达量均显著升高（P＜0.01或P＜0.05），而肠润方低剂量组与模型组比较无显著差异（P＞0.05）。其中，肠润方高、中、低剂量组的SCF表达量呈逐渐下降的趋势。见图2。

图2 免疫组化检测各组大鼠结肠中SCF分布与表达情况（SP×400）

2.3 Western Blot 检测各组大鼠结肠组织中c-kit、SCF蛋白的表达与空白组比，模型组、麻仁丸组、肠润方低剂量组c-kit 表达显著降低（P＜0.001 或P＜0.01），中、高剂量组无显著差异（P＞0.05）；与模型组比，麻仁丸组及肠润方高、中剂量组c-kit表达显著升高（P＜0.001），肠润方低剂量组无显著差异（P＞0.05）。见图3A、3B。

与空白组比，模型组、麻仁丸组、肠润方中、低剂量组SCF 表达显著降低（P＜0.001 或P＜0.01），高剂量组无显著差异（P＞0.05）；与模型组比，麻仁丸组、肠润方高、中剂量组SCF 表达显著升高（P＜0.001），低剂量组无显著差异（P＞0.05）。见图3A、3C。

图3 western blot检测大鼠结肠组织c-kit、SCF的蛋白水平

2.4 RT-PCR 检测各组大鼠结肠组织中c-kit、SCF mRNA的表达与空白组比，模型组、麻仁丸组、肠润方中、低剂量组c-kit mRNA 表达显著降低（P＜0.001或P＜0.01 或P＜0.05），高剂量组无明显差异（P＞0.05）；与模型组相比，麻仁丸组、肠润方高剂量组、中剂量组中c-kit 表达显著升高（P＜0.001 或P＜0.05），低剂量组无显著差异（P＞0.05）。见图4。

与空白组相比，模型组、麻仁丸组、肠润方低剂量组中SCF mRNA 表达均显著降低（P＜0.001 或P＜0.01），高、中剂量组无明显差异（P＞0.05）；与模型组相比，麻仁丸组、肠润方高、中、低剂量组均显著升高（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）。见图4。

图4 RT-PCR检测大鼠结肠组织c-kit、SCF mRNA表达水平

3 讨论

肠道平滑肌与心脏相同，也表现其自主的电节律性，它起源于肌间神经丛周围的起搏细胞，称为Cajal间质细胞。ICC通过自发产生的节律性慢波控制肠道收缩的节点、频次与方向，慢波由肠神经-ICC-平滑肌细胞网络间的缝隙连接传播，最终引发平滑肌的周期收缩[5]。ICC介导胃肠道肌电活动的起搏，同时也是肠内神经元向胃肠道平滑肌细胞传递信号的必要条件[6]，因此它被认为对胃肠运动的调控至关重要。ICC的缺失和功能受损直接影响了胃肠道的正常运动，可引起便秘、糖尿病胃轻瘫、功能性消化不良等胃肠动力障碍性疾病。在FC患者中相当一部分人表现为结肠排空迟缓，而结肠动力减弱是造成这些患者排空迟缓的原因。充分的证据显示[7-9]，FC的发生与ICC的改变密切相关。研究表明[10-11]，慢传输型便秘（STC）患者结肠组织中ICC 数量与体积较正常人明显降低。一项对20例重度便秘患者结肠次全切除术的病理研究显示，有60%的患者出现ICC 发育不全[12]。本研究采用复方地芬诺脂制备FC 大鼠肠动力障碍模型，通过免疫组化法对大鼠结肠组织进行观察，模型组c-kit、SCF 的表达明显降低，证实ICC 参与了FC 的发病机制。

在ICC 的发育、分化及表型的维持中c-kit、SCF及其组成的c-kit/SCF 信号通路扮演了重要的角色。c-kit 是由人染色体4q11～12 的原癌基因c-kit 编码的跨膜蛋白，由于其特异性表达于ICC，ICC可以通过标记c-kit抗体来识别。c-kit在胞外配体结合区与神经元表达的配体干细胞因子SCF 结合，SCF 发生二聚化后c-kit单体结构发生改变，产生均聚，导致细胞膜上氨基残基的自动磷酸化，启动SCF/c-kit 信号通路，介导各种第二信号分子调节ICC的细胞功能[13]。研究表明[14]，ICC与平滑肌细胞都来源于Kit阳性的前体细胞群，接受Kit 信号转导的Kit 阳性前体细胞保留Kit 的表达并发展为功能性ICC，而未经该途径转导的Kit阳性前体细胞则成为平滑肌细胞，提示Kit信号在对ICC种群的发育和维持至关重要。Tong W等[15]研究发现，对小鼠注射抗c-kit 单克隆抗体阻断c-kit 后，小鼠肠内ICC 几乎消失，监测电节律变化显示慢波活动丢失，局部应用SCF后发现经c-kit信号阻断的ICC数量和空肠电节律恢复，提示SCF激活的c-kit信号通路是调控ICC存活和增殖的关键途径。在本研究中，与空白组相比，模型组c-kit、SCF 在结肠组织的表达明显降低，c-kit、SCF 蛋白及其基因表达水平下降。免疫组化结果显示c-kit、SCF的表达与肠润方剂量呈正相关，经肠润方（高、中剂量组）治疗，大鼠结肠组织ckit、SCF 蛋白及c-kit mRNA、SCF mRNA 表达明显升高，说明FC 的发生及ICC 的改变与c-kit、SCF 表达异常、c-kit/SCF 信号通路受阻相关，实验进一步表明肠润方治疗FC是通过介导c-kit、SCF mRNA 的表达，提高c-kit、SCF 蛋白的表达，从而修复c-kit/SCF 信号通路，提高ICC的数量和功能，促使ICC恢复对胃肠道节律的正常调控。

中医认为正虚邪恋，缠绵不愈，正气不足是导致慢性便秘的根本原因。FC 病机在于阴血不足，肠道失润，亦或是气虚气滞，推动无力，或两者兼有。治疗便秘时不应局限于通便，而应从患者自身整体状况出发，发挥中医整体把握、病症兼顾、平衡阴阳及调和气血的优势，改善便秘症状的同时减少其并发症，从而提高患者生存质量。基于上述认识，笔者提出“以补通秘”的治疗原则，其目的是通便不用泻药，通过健脾行气、滋阴润肠，促进肠道蠕动而达到标本兼治。肠润方是以“滋阴行气”为基本治法，具有滋阴益气、行气润肠的功效。肠润方治疗FC 临床疗效显著，有效提高患者生存质量，近期有效率达90.0%，随访3个月有效率67.5%[2-3]。方中君药白术甘温补虚，归脾、胃经，既可补气又兼健脾，脾气健运则胃得以行其津液，胃肠分泌旺盛，蠕动增强，津行肠润而运肠，则肠枯便停之势得缓。玄参苦、咸、微寒，壮水之主，启肾水而能治肠燥舟停之液干；麦冬甘、寒，益阴生津，在《药品化义》尚有“治虚人元气不运，胸腹虚气痞满”的补气之说，玄参、麦冬配伍，增液益气而水流舟行，与方中其他药物相伍，泻而不峻，润而不腻，二者共为臣药。火麻仁甘、平，归脾、胃、大肠经，质润多脂，滋阴养血，润肠通便，善于治疗津血亏虚之肠燥便秘；枳实苦、辛、微寒，具有行气导滞，通导肠腑积滞的功效；槟榔辛温，行气布津，归胃与大肠二经，与方中诸味滋阴药物配伍开辛润之用，三者共为臣使之药。火麻仁配伍白术可益气养阴润肠；枳实配伍白术，取枳术丸之意，益气行津濡润肠道，起到消补兼施的作用；槟榔破气消积，配伍枳实，行胃肠之积滞通调肠道。诸药相合，共奏健脾行气、滋阴润肠之功，具有补重于消，寓消于补，以补为通的特点。

本研究表明，肠润方可明显提高c-kit、SCF 蛋白表达及c-kit、SCF mRNA 的表达水平，通过修复c-kit/SCF 信号系统恢复ICC 对胃肠道电节律的正常调控，达到促进肠道蠕动，恢复胃肠道动力的作用。前期研究表明[4]，肠润方亦可通过激活P38MAPK信号通路调控AQP3、AQP9 的表达，起到促进黏膜分泌黏液润滑肠道作用。肠润方治疗便秘具有多靶点的优势，通过整体调控而达到行气润肠的效果，进一步阐明基于滋阴行气法的中医药治疗FC的现代医学机制。