四川核桃遗传资源评价及优良无性系选育

时羽杰，汪志燚 ，糜加轩，肖 徐，万雪琴

（四川农业大学林学院，成都 611130）

核桃系胡桃科（Juglan daceae）胡桃属（Juglans）与山核桃属（Carya）一些具有经济和栽培价值的种的统称[1]，包括核桃（Juglans regia）[2]、山核桃（Carya cathayensis）[3]、长山核桃（Carya illinoensis）[4]和泡核桃（J.sigillata）[5]4个种。核桃为世界四大干果（核桃、扁桃、腰果、榛子）之首，素有“木本油料之王”的称号，是重要的食用干果和油料树种，在我国粮油安全和新能源战略中有重要地位[6]。核桃仁富含脂肪、蛋白质、碳水化合物及多种维生素，具有极高的营养价值，还含有微量生物活性物质，具有医疗保健作用[7]。通过加工、提炼生产的核桃油中饱和脂肪酸含量极低，一般不到脂肪酸总量的10%，而不饱和脂肪酸含量极其丰富，一般占总量的90%以上，尤其是亚麻酸和亚油酸，是AA、DHA和EPA等重要代谢产物的前体物质，对预防疾病维持人体健康，调节生理机能具有重要作用[8-10]。我国是核桃的起源中心，距今已有2000多年的栽培历史，核桃在我国分布区域甚广，几乎遍布我国各省，其中以云南、贵州、四川西部和西藏南部为最主要的栽培区[11]。

我国核桃的选优工作最早于20世纪60年代在东北地区开展，科研人员首先在辽宁和山西等地方筛选出大量优质品种核桃株系，率先引种到西北地区栽培。并从那时起各地都在结合乡土树种的资源，栽培选育出适地适树的核桃良种[12]。西南方地区虽然栽培核桃历史悠久，但品种选育严重滞后，科技支撑十分薄弱，产业化水平低。西南方地区气候温暖湿润，病虫害易发生且扩散快，使核桃长势、产量和品质性能降低，甚至植株死亡[13]，严重遏制了核桃产业发展。

四川省作为我国核桃主产地之一，种植历史悠久，种植面积大，分布广泛，但由于缺乏良种和盲目引种，导致产量和质量始终没有很大的提升。近年来，随着国家对核桃产量的大力支持，这一地区核桃栽培面积迅速扩大，但产业效果仍然不理想。第一，由于该区域核桃育种起步较晚，基地化栽培较少，实生繁殖占绝大多数[14]，只有极少数地方实行良种的推广。实生苗遗传稳定性差，开花结实晚，后代分离广泛，果实良莠不齐，存在着果壳厚、取仁难、出仁率低、产量差等缺点，严重缺乏市场竞争力[15]。第二，由于缺少适宜的良种，科技支撑薄弱，未做到适地适树，致使该地区大量引种北方和云南的核桃品种进行栽培[16]。而四川气候与北方差异较大，该地区夏季高温、湿润、多雨，使得这些品种无法适应，出现严重病虫害、落花落果等不良症状，产量和效益急剧下降。针对该地区特殊的自然地理条件，选育出适宜该地区栽培，具有较高抗性的品种来解决核桃产业发展中出现的问题，对于打造可持续发展的核桃产业体系具有重要的意义。因此，在课题组前人研究的基础上对初筛后的核桃无性系的17个主要性状指标进行测试[13，15]，并采用主成分分析法，分析出各成分性状和综合性状优良的核桃无性系，评价其相应的利用类型及综合表现，为核桃资源的分类利用和选优提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

依据四川核桃资源的分布状况，四川农业大学核桃课题组于2009—2010年在四川马边、峨边彝族自治县等地进行乡土核桃种质资源调查评价并收集了185个优良单株。并将其穗条经嫁接建立优树无性系，2011年3月将1 a生嫁接苗栽植于四川农业大学崇州教学科研基地，作为无性系试验林，株行距4 m×5 m，造林后只进行摘顶、除草等简单管理，不进行施肥、打药和病虫害防治。并于2011—2013年对185个无性系的幼年期生长状况进行测评，又于2014—2017年对其进行了初产期测评，在此基础上筛选出65个较优良的无性系作为本试验研究对象。

1.2 试验地概况

试验地位于崇州市桤泉镇以北与隆兴镇交界处四川农业大学现代农业研发基地。试验区主体位于桤泉镇，总占地面积155.8 hm2，地形平坦。属于亚热带湿润季风气候，四季分明，春秋短，冬夏长，雨量充沛，光照偏少，无霜期较长。年平均气温15.9℃，最热月为7月，平均气温24.7℃，最冷月为2月，平均气温4.9℃，温差为19.8℃。年平均日照时数为1 161.5 h，年降雨量1 012.4 mm。降雨多集中于夏季，而冬季较少，夏季为588.0 mm，冬季为29.9 mm。无霜期为285 d，气候温和适宜。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃适应性和抗病性的评价

地径测量：用围尺测量高于地面20 cm处的树干周长即为地径，并分别计算每个无性系号的平均地径；抗病性测定：初筛后的无性系各选取5个正常单株，在每株中下部高1～2 m的外围随机选取20个果子，共计100个，调查记录明显发病的青果个数取平均值。黑斑病主要在5月底至6月初（黑斑病发病高峰期）进行调查[17]，出现1个或1个以上，长度3 mm的浸渍状病斑，则记为明显发病。炭疽病主要在7月底至8月中旬（炭疽病发病高峰期）进行调查[18]，出现1个或1个以上直径为3 mm以上的圆形病斑，则记为明显发病。每10 d调查1次，共进行3次调查。将果部发病率记为N，抗病性评价标准如下：

高抗（HR），0≤N＜5%，表现为无明显症状；

抗（R），5%≤N＜10%，表现为发病轻微；

感（S），N≥10%，表现为发病严重；

抗战结束以后，中国农村经济在长期战乱与自然灾害多重打击之下，风雨飘摇，农村经济政策仍以发展农业生产为主，因此合作组织仍以农业生产合作社为组织重点，农业生产合作社占比进一步增大，同时围绕农业生产之运销、消费、供给等合作社也有所发展。而信用合作社占比则持续下降，至1949年信用合作社占比已不足30%。

1.3.2 核桃经济指标的测定

单株产量：将初筛后的9个无性系各单株进行编号，成熟后将每个无性系的单株青果全部采摘后进行称量取平均值；坚果的三径（腹径、缝径、果高）、壳厚、果尖高、缝合线高、内种皮厚度：用电子游标卡尺测量，3次重复，精确至0.01 mm；出仁率：测量坚果的单果重、仁质量，3次重复并计算出仁率；粗脂肪和粗蛋白质含量测定：分别采用索氏提取法和凯氏定氮法[19]；取仁难易、饱满度、果仁风味、种仁颜色、内种皮口感：采用品鉴描述法，成立固定有专业经验的品鉴小组，对每个无性系核桃进行品鉴评价，3 次重复，每个指标都有 0、1、2、3这4个等级，便于进行主成分分析评价。

1.4 数据处理

应用Excel 2013进行数据的统计，采用SPSS 26.0软件对统计后的数据进行方差分析、LSD多重比较和主成分分析，再结合Origin 2019将数据进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 生态适应性评价

生态适应性评价一般是通过植物的生长发育状况进行评价，具体表现为营养生长状况，是否正常开花结实，是否正常越冬越夏。根据前期研究结果表明，参试无性系都能正常开花结实，越冬越夏。因此这些核桃无性系在试验地生长良好。目前，需要从众多品系中筛选出综合价值较高的核桃无性系，营养生长状况能反映所栽培的无性系对试验地环境条件的适应程度。因此，通过测定其地径作为基础营养指标筛选出生态适应性较好的无性系。参试的65个无性系全部植株平均地径为12.5 cm，各无性系平均地径的变幅为7.50～18.10 cm。筛选出大于平均地径的无性系共计33个，分级结果如表1所示。对筛选后的33个无性系的地径进行显著性差异分析，结果如图1所示，发现CZ-86的地径最大，达到18.1 cm，且与其他无性系间均有显著性差异（P＜0.05），而 CZ-43、CZ-52、CZ-65、CZ-105、CZ-197、CZ-198的地径都较小，且无显著性差异。33个无性系植株地径整体变异系数为11.1%，相对较小，说明筛选出的无性系对生态适应性整体较高。

2.2 抗病性性评价

在核桃黑斑病与炭疽病盛发期，分别对各无性系果实发病率进行调查，结果如表2、表3所示，各无性系的平均发病率均呈上升趋势。其中CZ-66、CZ-81、CZ-197、CZ-198黑斑病较为发病严重外，其余无性系的发病情况都表现为无明显症状或轻微发病。而在炭疽病方面，除CZ-69表现为发病严重外，其余无性系的发病情况都表现为无明显症状或轻微发病。另一方面，根据同课题组对核桃无性系叶片黑斑病和炭疽病抗病性研究表明，高抗黑斑病无性系有 CZ-301、CZ-86、CZ-65、CZ-100、CZ-64、CZ-71、CZ-91、CZ-92、CZ-105 和 CZ-199，高抗炭疽病无性系有 CZ-86、CZ-200、CZ-100、CZ-64、CZ-199、CZ-71、CZ-92 与 CZ-91。对比本试验结果发现，虽然核桃叶片、果实的抗病机制有所不同，且叶片的发病程度明显高于果实，但核桃叶片的抗病规律与果实基本一致。因此，可以用果实的发病率去统计评价核桃的抗病等级。综合表2和表3的结果所示，筛选出9个生长势及抗病性优良的无性系CZ-64、CZ-65、CZ-71、CZ-86、CZ-91、CZ-92、CZ-100、CZ-199、CZ-301，进行核桃综合品质的分析。

表1 不同核桃无性系地径分级表Table 1 Ground diameter classification table of different walnut clones

图1 筛选后的不同核桃无性系地径差异Figure 1 Ground diameter difference of different walnut clones after screening

表2 田间调查核桃果实黑斑病自然发病率动态变化Table 2 Field investigation on the dynamic changes of natural incidence of black spot in walnut fruit

续表2

表3 田间调查核桃果实炭疽病自然发病率动态变化Table 3 Field investigation on the dynamic changes of natural incidence of anthracnose in walnut fruit

续表3

2.3 优良无性系选育

将筛选后的适应性和抗病性较强的9个核桃无性系中17个重要指标（产量X1、单果重X2、三径X3、壳厚 X4、出仁率 X5、粗蛋白含量 X6、粗脂肪含量X7、缝合线高 X8、果尖高 X9、饱满度 X10、取仁难易X11、干果仁风味 X12、种仁颜色 X13、内种皮厚度 X14、内种皮口感X15、鲜果取仁难易X16、鲜果仁风味X17）进行主成分分析，计算特征值和贡献率。由表4可以看出，有5个主成分的特征值大于1，累积贡献率为92.396%，表明这5个主成分已经将9个核桃无性系的主要指标92.396%的信息反映出来，因此，可以选取前5个主成分作为核桃无性系选育指标的综合评定标准。

核桃无性系选育指标的主成分因子载荷矩阵如表5所示，主成分分析成分矩阵代表解释变量在各主成分中的权重和影响方向[20]。第一主成分（PC1）主要综合了单果重、三径、壳厚、出仁率、饱满度、取仁难易的信息，可以看作是对核桃干果描述的指标；第二主成分（PC2）主要综合了种仁颜色、内种皮厚度、内种皮口感、鲜果取仁难易的信息，可以看作是对核桃鲜果描述的指标；第三主成分（PC3）主要综合了产量、缝合线高、果尖高的信息，可以看作是对核桃果形描述的指标；第四主成分（PC4）主要综合了粗脂肪含量和鲜果仁风味的信息，其中粗脂肪含量拥有较大的正系数而鲜果仁风味有较大的负系数，说明PC4得分越高，粗脂肪含量越高，而鲜果仁的风味越差，可以看作是对核桃粗脂肪含量描述的指标；第五主成分（PC5）主要综合了粗蛋白含量和干果仁风味的信息，其中粗蛋白含量拥有较大的负系数而干果仁风味有较大的正系数，说明PC5得分越低，粗蛋白含量越高，而干果仁的风味越差，可以看作是对核桃粗蛋白含量描述的负指标。

表4 主成分分析总方差解释Table 4 Total variance interpretation of principal component analysis

Y1=0.002X1-0.089X2-0.128X3-0.156X4+0.179X5+0.014X6-0.067X7-0.054X8+0.005X9+0.233X10+0.205X11-0.069X12-0.173X13-0.038X14+0.018X15-0.031X16-0.104X17

Y2=0.067X1-0.055X2-0.069X3+0.102X4+0.002X5-0.038X6+0.042X7+0.015X8-0.261X9-0.126X10+0.054X11-0.056X12+0.189X13-0.199X14+0.295X15+0.366X16+0.022X17

表5 主成分分析旋转成分矩阵Table 5 Principal component analysis rotational component matrix

表6 主成分分析成分得分系数表Table 6 Principal component analysis component score coefficient table

Y3=0.216X1-0.068X2+0.050X3-0.129X4+0.228X6-0.051X7+0.327X8+0.365X9-0.061X10-0.142X11+0.054X12+0.144X13+0.017X14-0.067X15-0.179X16+0.069X17

Y4=-0.167X1-0.015X2-0.055X3-0.064X4+0.013X5+0.182X6+0.407X7-0.122X8+0.132X9-0.076X10-0.053X11+0.101X12+0.111X13+0.034X14-0.075X15+0.039X16-0.349X17

Y5=-0.147X1-0.050X2-0.011X3+0.030X4-0.067X5-0.492X6+0.161X7-0.131X8+0.208X9-0.041X10-0.055X11+0.655X12+0.091X13-0.006X14-0.073X15-0.035X16+0.062X17

Y综=0.322 2Y1+0.196 15Y2+0.174 66Y3+0.143 25 Y4-0.087 7Y5

将5个主成分和综合成分得分计算后进行大小依次排序，可以来权衡每个因子在每个无性系中所处的位置与分量，从而较直观地判断核桃的用途及优良性。由表7可知，9个核桃无性系中第1主成分（干果指标）Y1得分排序为 CZ-65＞CZ-100＞CZ-64＞CZ-199＞CZ-71＞CZ-91＞CZ-301＞CZ-86＞CZ-92；第2主成分（鲜果指标）Y2得分排序为CZ-71＞CZ-92＞CZ-64＞CZ-91＞CZ-65＞CZ-100＞CZ-199＞CZ-301＞CZ-86；第 3主成分（果形指标）Y3得分排序为 CZ-64＞CZ-65＞CZ-86＞CZ-92＞CZ-91＞CZ-100＞CZ-199＞CZ-301；第 4主成分（粗脂肪含量指标）Y4得分排序为 CZ-199＞CZ-65＞CZ-100＞CZ-92＞CZ-91＞CZ-86＞CZ-64＞CZ-71＞CZ-301；第 5 主成分（粗蛋白含量负指标）Y5得分排序为CZ-91＞CZ-199＞CZ-64＞CZ-86＞CZ-92＞CZ-301＞CZ-71＞CZ-65＞CZ-100；Y综综合得分排序为 CZ-65＞CZ-64＞CZ-100＞CZ-199＞CZ-71＞CZ-91＞CZ-301＞CZ-86＞C Z-92。

3 讨论与结论

主成分分析法将多个性状指标转化为彼此相互独立的个数较少的主成分，通过其相应的成分得分来评价植株的优良性状及用途，既能体现个体的特异性优点，又能对整体的综合性状表现选择程序进行简化和量化，同时也避免了性状间相互作用造成的重复选择，较人工打分和单一性状选育更加的快捷且具有科学性[21-22]。杨俊霞等[23]对15个晚熟核桃品系的8个主要经济性状（坚果产量、横径、单果重、壳厚、出仁率、仁重、粗脂肪和粗蛋白含量）进行主成分分析，利用4个主成分得分来综合选择优良品种；黄晓露等[14]对广西地区81株核桃单株的11个性状（坚果三径、单果重、出仁率、壳厚、粗脂肪含量、粗蛋白含量、各脂肪酸含量）进行主成分分析，利用4个主成分的单一和综合得分分别进行单项优异性状和综合性状的核桃单株选育；甄知娅等[24]对西南地区24个良种核桃的7个主要经济指标（壳厚、单果重、仁重、出仁率、三径、粗蛋白和粗脂肪含量）进行主成分分析，利用2个主成分综合得分进一步评价不同良种的经济功能及用途；孙 垟 等[1]对44株核桃优良单株的16个主要经济性状（产量、三径、干果重、壳厚、仁重、出仁率、粗脂肪和粗蛋白含量、果形、色泽、果面、取仁难易、仁颜色、饱满度、风味、内隔壁）进行主成分分析，利用6个主成分得分筛选出不同用途及综合性状优异的核桃，且评价结果与实际表现接近；F.Sinesio等[25]对不同欧洲国家的18个核桃无性系品种的15个感官指标（壳颜色、壳白度、壳粗糙度、壳硬度、仁饱满度、仁形状、仁硬度、取仁难易、甜味、风味浓度、涩味、苦味、香味、内种皮颜色和厚度）进行主成分分析，利用2个主成分得分进行核桃综合感官评价。

表7 不同核桃无性系的主成分得分Table 7 Principal component scores of different walnut clones

本研究通过对四川地区65个核桃无性系进行适应性及抗病害能力的初步筛选，选择适应性和抗病性较强的9个核桃无性系，对其17个经济性状指标（产量、单果重、三径、壳厚、出仁率、粗蛋白含量、粗脂肪含量、缝合线高、果尖高、饱满度、取仁难易、干果仁风味、种仁颜色、内种皮厚度、内种皮口感、鲜果取仁难易、鲜果仁风味）进行主成分分析，提取了代表原性状92.396%的5个主成分，分别是干果指标、鲜果指标、果形指标、粗脂肪含量指标和粗蛋白含量负指标，通过其相应的单一和综合得分来评价核桃的经济性状及用途。以干果指标评价，CZ-65、CZ-100、CZ-64评价指数较高，其出仁率高、果实饱满、果壳较薄且容易取整仁，适合用于核桃干果的开发；以鲜果指标评价，CZ-71、CZ-92、CZ-64评价指数较高，其内种皮较薄且无苦涩味，口感香甜，易取整仁，适合用于核桃鲜果的开发；以粗脂肪含量指标评价，CZ-199、CZ-65、CZ-100评价指数较高，其粗脂肪含量高，但鲜果仁的风味差、较苦涩，适合用于核桃油用果的开发；以粗蛋白含量负指标评价，CZ-100、CZ-65、CZ-71评价负指数较高，其粗蛋白含量较高，但干果仁风味较一般，适合用于核桃乳、核桃粉等高营养价值的副产品开发；以综合性状指标评价，CZ-65、CZ-64、CZ-100 综合评价指数较高，其整体经济性状较为突出，可以作为优良的种质资源进行保存，在今后的实际应用中，进行良种扩繁和应用。