芦笋中总黄酮在D101大孔吸附树脂上静态与动态吸附性能研究

雷雅婷张也罗堃王元清蒋波5严建业

(1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2. 湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；3. 湖南省永州市中医医院，湖南 永州 425000；4. 中南林业科技大学生命科学与技术学院生物技术与工程实验室，湖南 长沙 410004；5. 湖南省药品审评认证与不良反应监测中心，湖南 长沙 410013)

芦笋为禾本科芦苇属(PhragmitesAdans.)植物芦苇(P.communisTrin.)的嫩芽，具有丰富的营养和药用价值，被誉为“洞庭虫草”。研究表明[1-2 ]，芦苇植物的芦根、芦叶、芦花、芦茎、芦笋等含有丰富的化学成分，包括黄酮类、酚酸类、多糖类等，其中黄酮类成分为芦苇的主要成分。目前，芦根与芦叶等相关研究报道较多[3-4]，特别是百合科天门冬属多年生宿根性草本植物的地上茎也称之为“芦笋”，它的研究报道也比较丰富[5]，而对于禾本科芦笋的研究报道零星可见。大孔吸附树脂是一类内部具有较大间隙结构的高分子吸附树脂，大量的微观颗粒组成宏观的球状颗粒，并且在微观颗粒之间存在间隙，所以大孔树脂可以大量吸附分离有机物，并且广泛应用于食材药材的活性成分分分离纯化研究[6]。本文将研究禾本科芦笋中总黄酮在大孔吸附树脂上静态与动态吸附性能，优选芦笋总黄酮纯化工艺，为禾本科芦笋食品产品开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 芦丁标准品(宝鸡市辰光生物科技有限公司)；氢氧化钠(天津市大茂化学试剂厂)；亚硝酸钠(湖南汇虹试剂有限公司)，硝酸铝(天津市科密欧化学试剂有限公司)，盐酸(株洲石英化玻有限公司)，95%乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)均为分析纯；蒸馏水(中南林业科技大学生命科学与技术学院实验室)。

1.2 实验材料 芦笋采于湖南沅江；D101大孔树脂、AB-8大孔树脂与HPD100大孔树脂(购于东鸿化工有限公司)。

1.3 实验仪器 SHB-Ⅲ循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；光照恒温(恒湿)摇床(上海天呈实验仪器制造有限公司)；YRE-2000旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；DK-2000-Ⅲ电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；UV-5500型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；202-OA型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 D101大孔吸附树脂的预处理 参照文献方法[7]，对D101大孔树脂进行95%乙醇洗、蒸馏水洗、5%盐酸洗、蒸馏水洗、2%氢氧化钠洗、蒸馏水洗等过程去掉树脂中的杂质，抽滤，置于冰箱冷藏，备用。

1.4.2 芦笋的预处理 称取晒干后的芦笋150 g置于2000 ml的烧瓶中，加入体积分数为80%的乙醇提取3次，加乙醇量分别为1500 ml、1200 ml、1200 ml，水浴加热回流提取时间分别为1.5 h、1.0 h、1.0 h，合并滤液，利用旋转蒸发仪将滤液浓缩至体积为浓度为1∶0.5(约300 ml)的样品溶液，存放在冰箱冷冻室，备用。

1.4.3 芦丁标准曲线的制备 精确称量芦丁标准品10.50 mg置于25 ml的容量瓶中，80%乙醇溶液溶解，定容后摇匀。精确吸取标准溶液0.0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，均置于10 ml的容量瓶中，加入0.3 ml 5%亚硝酸钠，摇匀后静置6 min，再加入0.3 ml 10%硝酸铝，摇匀后静置6 min，加入4 ml 4%氢氧化钠溶液，蒸馏水定容，摇匀后静置15 min，在510 nm处分别测量吸光值，绘制标准曲线。以标准品浓度(x)和吸光值(y)进行拟合回归方程，标准曲线方程为：y=12.524x-0.0043，R2=0.9987。

1.4.4 样品中总黄酮的测定 取适量样品溶液，照1.4.3的方法进行显色，测定吸光值，计算样品中总黄酮的含量。

1.4.5 静态吸附性能的考察

1.4.5.1 三种大孔吸附树脂对芦笋总黄酮的静态吸附率 分别精确称量预处理之后的D101、AB-8、HPD100大孔树脂各1.00 g分别置于三个容量为100 ml的三角瓶中，精确加入样品溶液(浓度为1∶0.5)10 ml，置于25℃恒温条件下，在110 r/min的摇床中振荡吸附24 h，吸取上清液，测定总黄酮的含量，芦笋总黄酮在D101、AB-8、HPD100三种大孔吸附树脂上的吸附率。

1.4.5.2 三种大孔吸附树脂对芦笋总黄酮的静态解吸率 将吸附饱和的D101、AB-8、HPD100大孔树脂均用50 ml蒸馏水淋洗，将25 ml体积分数为95%的乙醇溶液加入饱和树脂中，置于25℃恒温条件下，以110 r/min的摇床中振荡吸附24 h，吸取上清液，测定总黄酮的含量、芦笋总黄酮在D101、AB-8、HPD100大孔吸附树脂上的解吸率。

1.4.5.3 静态吸附动力学曲线 精确称量处理之后的D101、AB-8、HPD100大孔树脂各1.00 g，分别置于容量为100 ml的三个锥形瓶中，精确加入样品溶液20 ml，置于25℃恒温条件下，在110 r/min的摇床中振荡并计时，在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h时取适量上清液测定总黄酮的含量，绘制芦笋总黄酮在D101、AB-8、HPD100大孔吸附树脂上的静态吸附曲线。

1.4.6 动态吸附性能的考察

1.4.6.1 动态吸附径高比的选择 精确称量等量的D101大孔吸附树脂三份，分别采用湿法装柱于3根内径不同的树脂柱中，使其径高比分别为1∶3、1∶4、1∶5，量取3份质量浓度为1∶0.25的样品溶液上样于3根树脂柱，上样量为2树脂装柱体积(BV)，静置4 h。调节开关，使样品溶液以1 BV每小时的流速经过D101大孔树脂柱，用4 BV水洗，合并过柱样品液与水洗液，定容至100 ml，测定总黄酮的含量，选出最佳的径高比。

1.4.6.2 动态吸附泄露曲线的测定 精确称量一定的D101大孔吸附树脂，湿法装柱，使树脂柱的径高比为1∶5，量取2 BV质量浓度为1∶0.25的样品溶液上样于树脂柱中，静置4 h，调节开关，使样品溶液以1 BV/h的速度流过大孔树脂柱，每4 ml泄露液装于离心管中，测定黄酮含量，绘制泄露曲线。

1.4.6.3 动态吸附洗脱剂体积分数的确定 将装柱后的树脂柱先用5 BV蒸馏水洗，先后用体积分数10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液各50 ml洗脱，将各洗脱液测定总黄酮含量，计算黄酮洗脱率。

1.4.6.4 动态吸附水洗体积的确定 精确称量一定的D101大孔吸附树脂，湿法装柱，使树脂柱的径高比为1∶5，量取2 BV质量浓度为1∶0.25的样品溶液上样于树脂柱中，静置4 h，调节开关，使样品溶液以1 BV/h的速度流过大孔树脂柱，反复上样3次，再用蒸馏水洗，分段收集水洗液，每段收集1 BV。实验观察每段水洗液的Molish反应，确定最佳水洗体积。

1.4.6.5 动态吸附洗脱曲线 将1.4.6.4中的树脂柱用90%乙醇洗脱至树脂柱无色，将每10 ml洗脱液装于离心管中，测定洗脱液中的总黄酮含量，绘制洗脱曲线。

1.4.6.6 芦笋总黄酮纯度的验证 浓度为1∶0.25(水与样品的体积比)的样品5 BV上样于径高比1∶5的D101大孔树脂柱，静置4 h，7 BV水洗，60 ml 90%乙醇洗脱，重复3次，测定洗脱液中总黄酮的纯度。

2 结果与分析

2.1 静态吸附率和静态解吸率的测定结果 考察芦笋样品溶液中总黄酮在三种不同型号大孔树脂上的静态吸附量与解吸率，结果见图1。芦笋样品溶液中总黄酮在不同型号大孔树脂上的静态吸附量与解吸率存在差异，其静态吸附量大小关系为AB-8>D101>HPD100，采95%乙醇解吸附时解吸率大小顺序为HPD100>AB-8>D101。

2.2 静态吸附动力曲线 D101、AB-8、HPD100三种大孔树脂吸附芦笋样品溶液24 h，其总黄酮的静态吸附动力曲线如图2。芦笋总黄酮在各大孔吸附树脂上吸附较快，吸附前期吸附速度较快，当吸附时间在4 h左右时达到静态吸附平衡。综合三种树脂对芦笋总黄酮的静态性能分析，选择D101大孔吸附树脂进行动态性能考察。

2.3 动态吸附径高比考察 将样品溶液上样于不同径高比的D101大孔树脂柱中，测定每克树脂的总黄酮泄漏量，结果见图3。在测试的三个比例中，径高比为1∶5时，D101大孔吸附树脂的泄漏量最低，说明径高比为1∶5时芦笋总黄酮的吸附率最高。再综合考虑到吸附率和使用树脂的利用率，选用径高比为1∶5时对芦笋中总黄酮进行吸附分离。

2.4 动态吸附泄露曲线 将样品溶液上样于D101大孔树脂柱中，每4 ml一份，测定每份流出液中的总黄酮含量，泄漏量与流出液的的动态吸附泄露曲线见图4，芦笋总黄酮动态泄漏量-流出液体积的数学方程拟合情况见表1。由图4可知，样品从第8份开始有不同程度的泄露；由表1可知，总黄酮动态泄漏量-流出液的第7～11份数学方程模拟为：y=3.227x-21.044，线性关系较好，P值为0.007<0.05，表明模拟的数学方程具有统计学意义。

表1 D101大孔树脂总黄酮动态泄漏量-流出液体积数学方程

2.5 动态吸附洗脱剂的体积分数 将吸附饱和的D101大孔树脂水洗后用不同浓度的乙醇洗脱，测定洗脱液中的总黄酮含量，结果如图5。总黄酮在不同浓度的乙醇中都有洗脱，主要集中在50%乙醇洗脱液中，其洗脱量的关系大小为：50%乙醇 > 30%乙醇 > 70%乙醇 > 10%乙醇 >90%乙醇，特别是在90%的乙醇溶液中有部分总黄酮，因而可以采用90%乙醇洗脱总黄酮，可将其洗脱完全。

2.6 动态吸附水洗体积的确定 将5 BV样品溶液上样于D101大孔吸附树脂，反复3次，用不同倍量的水洗脱，molish反应判断终点，结果见表2。使用6 BV水洗后的水洗液molish反应仍然为阳性，而使用7 BV水洗后molish反应为阴性，表明在上样溶液被D101大孔吸附树脂柱吸附之后，至少需要使用7 BV的蒸馏水清洗树脂柱，才能去除糖类成分。

表2 D101大孔吸附树脂的动态吸附水洗体积

2.7 动态吸附洗脱曲线 将水洗后的样品，用90%乙醇溶液洗脱，测定不同洗脱体积中的总黄酮的含量，结果见图6。使用90%乙醇洗脱D101大孔吸附树脂中的芦笋黄酮类化合物，洗脱量先升高再降低，当洗脱溶剂达到60 ml时，洗脱出的总黄酮含量几乎为零，故而需要使用60 ml 90%乙醇进行洗脱。

2.8 验证试验 按照优化的动态吸附工艺进行上样于洗脱，测定洗脱液中总黄酮的纯度，重复3次，结果见表3。芦笋样品经过D101大孔吸附树脂纯化后，总黄酮的纯度提高了6.54倍。

表3 纯化工艺验证

3 讨论

大孔吸附树脂具有价格低廉、吸附性好、反复利用等特点，在药材的活性成分分离纯化研究中广泛应用[8-9]。D101大孔吸附树脂为苯乙烯骨架结构的非极性树脂，对禾本科芦笋中总黄酮具有较好的静态吸附与解吸附性能。黄酮类化合物作为一种天然抗氧化剂，其开发应用有非常大的发展前景[10]。本研究系统地考察了禾本科芦笋中总黄酮在D101大孔吸附树脂上静态与动态吸附性能，优选出了总黄酮纯化工艺。

禾本科芦笋中含有黄酮、酚酸、多糖等化学成分，具有良好的抗癌与抗氧化等活性[11]，而对其黄酮中的具体成分研究较少，比色法进行总黄酮含量测定时，通常以芦丁计，显色比较稳定，测定比较准确，因而在总黄酮的含量测定中以芦丁计，为总黄酮含量评价提供经典方法。

静态吸附量的比较中，本研究考察了芦笋样品溶液中总黄酮在三种不同型号大孔树脂上的静态吸附量与解吸率，静态吸附量大小关系为AB-8>D101>HPD100，采用95%乙醇解吸附时解吸率大小顺序为HPD100>AB-8>D101。可见，D101大孔吸附树脂对禾本科芦笋中总黄酮具有较好的静态吸附与解吸附性能。大孔吸附树脂的选择中，综合3种树脂(AB-8、D101、HPD100)对芦笋总黄酮的静态性能分析，最终选择D101大孔吸附树脂进行动态性能考察。动态吸附径高比考察中，在3个径高比(1∶3、1∶4、1∶5)下，径高比为1∶5时，泄漏量最低，可见径高比为1∶5对芦笋中总黄酮吸附量较高。D101大孔吸附树脂的纯化工艺可见，乙醇能有效溶解中草药中的黄酮成分[12]。特别是动态洗脱时，总黄酮在不同浓度的乙醇中均有洗脱，为了提高洗脱率，选择90%乙醇进行洗脱。进行分离纯化后，总黄酮纯度提高了6.54倍。

综上所述，D101大孔吸附树脂对禾本科芦笋中总黄酮具有较好的静态与动态吸附性能，可以用于禾本科芦笋中总黄酮的纯化，与其他纯化方法相比选择性强、价格合理，为各类中药中黄酮类化合物的纯化工艺研究提供了基础。