SC514对ARDS模型大鼠肺组织中MMP-2/9表达的影响

(1. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2. 广西壮族自治区卫生健康委员会，广西 南宁 530021)

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)为危重症科常见疾病，病死率为40%[1]。即使在之前的二十年中，其诊治手段获得了极大的进步，但其死亡率仍然很高[2]。适当的治疗决策和资源分配，对ARDS患者预后的诊疗至关重要。然而，病因复杂导致ARDS的诊断和治疗复杂，为了开发有效的治疗方法，有必要更好地了解ARDS的发病机制。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) 是一组依赖Zn2+离子并作用于细胞外基质的蛋白水解酶[3]。MMPs具有通过降解细胞外基质并影响细胞外基质重塑以参与ARDS病理机制进展的能力[4]。本次实验，我们使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的大鼠肺损伤的ARDS模型，研究SC514对LPS诱导的ARDS模型大鼠肺组织中MMP-2/9表达的影响，并探讨该途径作为ARDS治疗靶标的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠40只，(湖南天勤生物有限公司)，8周龄，每只质量(200±10) g。将这些实验动物全部饲养于右江民族医学院的SPF级实验动物房，实验室温度设置为22℃～24℃，湿度恒定在50%～70%，且给予相同标准的经过高温高压消毒的固体颗粒饲料，以每笼5只，饲养于8只笼子当中。适应性喂养1周后再进行实验。本次实验动物研究已通过右江民族医学院动物保护和使用委员会的审批。

1.2 主要试剂、仪器 LPS(Sigma，L2880)，SC514(GK 01140，MCE)，BCA蛋白定量试剂盒(ZJ101L，上海雅酶有限公司)，磷酸酶抑制剂(GRF102，上海雅酶有限公司)，RIPA裂解液(P0013D，上海碧云天公司)，Omni-EasyTMPAGE凝胶快速制备试剂盒(PG212，上海雅酶有限公司)，p-p65抗体(ab16502，Abcam)，GAPDH抗体 (ab9485，Abcam)，MMP-2抗体(ab97779，Abcam)，MMP-9抗体(ab76003，Abcam)，山羊抗兔IgG(H+ L)二抗(a32731，Thermo Fisher)，DAB显色试剂盒(DAB-0031，福建迈新公司)，SYBR Green( Roche)，逆转录试剂盒(Thermo Fisher)，Triol( Thermo Fisher)，BH2生物显微镜(Olympus)。

1.3 模型制备分组与标本采集 按照随机区间分组设计的原则将40只SPF级SD大鼠随机分配到4组内，分别为空白对照(NC组)，生理盐水(CTL)组，LPS组和LPS+SC514组，其中NC组不做任何处理，CTL组中大鼠支气管滴入生理盐水1 ml，LPS组中大鼠支气管滴入LPS10 mg/kg，LPS+SC514组：SC514 10 mg/kg腹腔注射30 min后予以LPS 10 mg/kg支气管滴入。24 h之后在大鼠腹腔注射水合氯醛溶液，深度麻醉大鼠后，取大鼠右肺上叶，放入甲醛中固定，后做成石蜡包埋病理切片，其余肺组织放入液氮中保存。

1.4 Western Blot检测NF-κB p65、MMP-2、MMP-9蛋白表达 用4℃的生理盐水清洗肺组织，加入磷酸化蛋白酶抑制剂RIPA裂解液(10 μl/mg)，匀浆机搅拌，收取匀浆液于1.5 ml EP管中，4℃，11000 r/min离心10 min，收取上清液。按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。每孔取45 μg总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳；湿转至PVDF膜；使用快速封闭液在室温下封闭半小时后，加入相应的兔抗鼠一抗抗体(1∶1000)，4℃下摇床孵育过夜。次日，用TBST重复洗膜3次，每次10 min后，加入相应的二抗，室温孵育40 min。用TBST重复清洗膜3次，每次10 min。加入ECL化学发光试剂，在凝胶成像系统上显影，最后用Image J软件分析目的条带。

1.5 免疫组化法检测肺组织病变 将大鼠肺组织的病理切片依次于二甲苯及不同浓度的乙醇中脱蜡、水化。并用PBS冲洗3 min×3次。放入枸橼酸溶液中，加热至95℃，15 min，抗原修复。PBS冲洗5 min×3次。加入过氧化物酶抑制剂，室温孵育8 min。PBS冲洗3 min×3次。封闭液封闭，去除封闭液滴加一抗，4℃孵育过夜。PBS冲洗5 min×3次。加二抗，PBS冲洗5 min×3次。滴入辣根过氧化物，PBS润洗3 min×3次。滴加DAB试剂，后脱水封片。

1.6 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)法检测大鼠肺组织MMP-2/9的表达 使用triol法提取总RNA，电泳检测总RNA的完整性。取0.8 μg总RNA配置逆转录反应体系，按逆转录试剂盒进行逆转录。MMP-2/9及GAPDH引物由上海生工合成并验证。以20 μl为总反应体系，GAPDH作为管家基因，每个样本3个副孔，采用采用2-△△CT法计算MMP-2/MMP-9的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织HE染色及免疫组化观察结果比较 NC组即空白组大鼠的肺组织HE染色结果：肺泡结构较清晰、完整，肺泡间隔无水肿，肺泡腔内未见组织液，肺组织中未见炎性细胞浸润；LPS组肺泡及肺间质水肿并有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚并可见肺泡腔缩小变形，部分肺泡塌陷，支气管腔和肺泡腔可见大量分泌物，肺毛细血管充血水肿；生理盐水对照组较空白组有少量的炎性细胞浸润，肺部有轻微损伤，肺微血管内皮损伤较轻。SC514组较LPS组损伤程度减轻，少量炎性细胞浸润，肺泡结构较为完整，细胞塌陷较少，出血、渗出较少，肺微血管内皮水肿较轻。比较各组大鼠肺组织免疫组化的MMP-2/9表达可见，较多表达在气道黏膜上皮细胞、血管内皮细胞、浸润的中性粒细胞和巨噬细胞等细胞中。LPS处理导致ARDS大鼠肺组织中MMP-2/9明显表达增加，SC514预处理后，降低了ARDS大鼠肺组织中MMP-2/9的表达。见图1。

2.2 各组大鼠肺组织Western Blot结果比较 见图2和图3，与NC组相比，LPS组中的MMP-2/9蛋白表达明显增高(P<0.05)，SC514预处理组中的MMP-2/9蛋白表达与LPS组相比明显下降(P<0.05)。

2.3 各组大鼠肺组织RT-qPCR结果比较 见图4，与NC组对比，LPS组MMP-2/9转录水平升高(P<0.05)，SC+LPS组与LPS组相比，MMP-2/9转录水平下降(P<0.05)。

注：*与NC组相比，P<0.05；#与LPS组相比，P<0.05

3 讨论

ARDS是失衡的炎症过程，以炎症细胞浸润为主要病理特征，并伴随肺微血管通透性的增加，以及弥漫性肺间质水肿和细胞外基质的失衡[5]。其中肺组织内的细胞外基质对肺的生理功能有重要的作用，细胞外基质通常处于一个动态的平衡中[6]。基质金属蛋白酶(MMPs)是机体的一种重要的水解酶，其特征在于在催化域和几个保守的蛋白域中具有保守的Zn2+结合基序[7]。这种重要的蛋白水解酶可降解细胞中的许多成分，与细胞外基质的自身稳定密切相关[8]。本课题组前期研究证实，在肺上皮A549细胞中，MMPs和基质金属蛋白酶抑制剂有较为广泛表达，并在炎症反应初期存在着双向改变[9]。MMPs的活性升高，可造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞基底膜的大量破坏[10]，肺组织的通透性增强，发生肺水肿和呼吸困难。基质金属蛋白酶中的MMP-2和MMP-9可通过信号传导而参与几种不同的细胞功能[11]，包括那些与炎症反应有关的信号传导。因此，MMP-2/9的失衡可能参与了ARDS病理的进展过程。

过度激活的NF-κB通路可能是ARDS发病机制的基础。有研究表明在新生大鼠模型中，NF-κB通路与参与了LPS诱导的急性肺损伤[12]，而血管紧张素转化酶通过抑制ERK1/2降低LPS诱导的大鼠肺损伤[13]。另一项证明重组人脑利钠肽通过抑制MAPK和NF-κB途径活化来减轻LPS诱导的人肺成纤维细胞的细胞损伤[14]。根据这些观察结果，本研究表明在ARDS大鼠模型中，肺组织NF-κB通路被异常激活，从而刺激了MMP-2/9的表达并加剧了肺损伤。本次实验结果展现了NF-κB/MMP-2/9信号转导轴在ARDS相关炎症中的作用，这可能会有利于进一步了解该疾病的分子机制。

根据实验结果，LPS组大鼠肺泡中存在大量炎性细胞浸润，肺泡腔隙缩小变形，并可见大量分泌物及肺间质水肿；而SC514组损伤程度均有不同程度的减轻，表明采用支气管滴注LPS方法复制大鼠ARDS模型成功。本次研究发现，正常大鼠肺组织MMP-2/9表达水平较低，LPS干预后MMP-2/9的蛋白表达水平及转录水平明显上调，进一步实验发现，应用SC514可下调LPS诱导升高的MMP-2/9表达，这说明MMP-2/9与LPS诱导的ARDS大鼠模型的肺损伤机制关系密切，值得对其进行深入研究。

综上所述，本次研究发现NF-κB通路在LPS诱导的ARDS模型大鼠肺损伤的过程中被明显激活，SC514的应用抑制了NF-κB通路，使MMP-2/9表达水平降低，从而减轻了LPS诱导的大鼠肺组织的炎症应激反应。尽管在大鼠的肺组织可以模拟出ARDS的炎症损伤表现，但ARDS病理机制复杂，仍需在细胞模型上作进一步探索。