雷公藤内酯醇在不同种属肝微粒中体外稳定性性别差异研究*

刘萍霞 庄笑梅 李 铮 张玉杰 张振清

(1联勤保障部队庐山康复中心 江西九江 332000；2军事医学科学院毒物药物研究所药物代谢与药代动力学重点实验室 北京 100850；3北京美迪克斯生物技术有限公司 北京 100012)

雷公藤内酯醇(Triptolide， PG490)又名雷公藤甲素，是从中药材雷公藤中分离出的环氧二萜内酯化合物，具有抗炎、抗风湿、免疫调节和抗肿瘤等作用，但由于毒性大，对皮肤和血管刺激性大限制了临床的进一步使用。目前，以PG490为母体进行修饰后研发的新药包括F60008、MC002[1-2]等。有文献报道PG490在大鼠体外代谢动力学存在性别差异[3]。课题组也进行了另一项PG490在大鼠体内代谢是否存在性别差异的研究，该实验主要是研究G490在体外不同种属不同性别肝微粒体代谢特点，再结合动物代谢性别差异体内外相关性分析，最终通过人肝微粒代谢性别研究来初步推测药物在人体内是否存在代谢的性别差异。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

PG490，纯度>98.5%，批号为020601，由北京美迪克斯生物技术有限公司提供；纳曲酮，纯度>99%，批号为051205，由军事医学科学院提供。甲醇为色谱纯，乙酸乙酯为分析纯，甲酸铵为分析纯，实验用水为重蒸水。

Finnigan TM TSQ Quantum三级四极杆串联质谱联用仪，配有电喷雾离子化源(ESI)；Finnigan TM Surveyor自动进样器和液相泵(美国 Thermo公司)；离心浓缩仪(美国LABCONCO公司)；高速离心机(美国Thermo公司)。XW-80A型漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；Sartorius BS110S电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，4Libror EB-330D电子分析天平(日本，岛津)。

1.2 肝微粒体

肝微粒体来源均购自于美国BD Gentest公司， 蛋白含量为20mg/mL，其中不同性别人肝微粒体为40人混合肝微粒体。

1.3 HPLC-MS/MSS 色谱质谱条件

色谱柱：Golden-C18柱(5μM，，2.1×100mm)(美国Thermo公司)，柱温25℃。流动相组成：甲醇：水(含5 mM甲酸铵)=55：45(v/v)，流速0.2mL/min。

质谱检测采用电喷雾(ESI)方式，正离子检测，鞘气压力为23psi，辅助气压力为11psi，喷雾电压4800V，毛细管温度280℃，源内碰撞诱导解析电压(Source CID)-10V。MC002、PG490和内标纳曲酮检测的m/z分别为446、361和3S42。选择性离子(SRM)方式检测m/z 446的碎片离子为m/z 165，m/z 361的碎片离子为m/z 128，m/z 342的碎片离子为m/z 324。Xcaliburl.4 SR1 采集分析数据。

1.4 实验方法

1.4.1 孵育体系各溶液的配置 ①肝微粒体：各种属肝微粒体在冰浴中解冻，实验前用预先冰浴的缓冲液配置成1.25mg/mL待用。②NADPH启动剂的配置：称取12mgNADPH溶于1.44mL的缓冲液。③PG490的配置：甲醇溶解，缓冲液稀释，浓度为10μM使得有机溶剂的比例要低于0.5%。

1.4.2 反应体系的组成 100μL药物加入80μL肝微粒体预孵5min，加入20μL NADPH启动反应，于时间点加入终止剂(含内标)，孵育时间为0、5min、15min、30min、1h、2h。

1.4.3 样品处理 样品涡旋混匀2min后，1200×g离心5min(4℃)，取上清液600μL，置离心浓缩仪30℃挥干，加入复溶剂溶液(组成与流动相相同)100μL复溶，12 600×g离心10min(4℃)，上清液10μL进样。

1.4.4方法验证 PG490药物在各种属肝微粒体中的特异性、标准曲线、日内精密度和准确度进行了考察。各肝微粒空白杂质对检测无干扰，标准曲线线性关系良好，R2均大于0.99，日内精密度<15%，准确度在85～115%之间，均符合生物样品检定要求。

1.5 数据处理与分析

将PG490在0时的浓度作为100%，其它时间点的浓度与0时的浓度相比得到PG490的剩余百分比。将各时间点的剩余百分比的自然对数与相应的孵育时间作图，经直线回归求得斜率( - κ )， 由公式(1)求得原药微粒体代谢T1/2(min)，应用 Well Stirred Mode l对微粒体的数据进行外推可以得到 PG490在 3个种属两个性别肝中的固有清除率 CLint和肝清除率 CLh。

T1/2 = -0.693/κ

(1)

(2)

(3)

2 结果

药物在大鼠肝微粒稳定性有性别差异，PG490孵育2h后雄性肝微粒体中转化了80%，而雌性大鼠转化了20%。PG490在雌雄大鼠肝微粒中孵育的稳定性比较见图1。

图1 PG490 在雌雄大鼠肝微粒中孵育不同时间

利用式(2)和式(3)计算出PG490大鼠肝中的固有清除率CLint和肝清除率CLh，见表1。而PG490在比格犬和人肝微粒体较稳定，孵育2h均转化不到15%，无法计算参数，未观察到代谢的性别差异。

表1 PG490在大鼠肝微粒体中代谢动力学

实验结果显示，PG490在大鼠不同性别肝微粒中代谢统计学上有差异，而在比格犬和人肝微粒中没有表现出性别差异。实验结果提示，不同种属PG490自身代谢特点不同，推测PG490的前体化合物如果在大鼠体内代谢表现出的性别差异有可能在于活性代谢产物PG490自身代谢存在差异。

3 讨论

肝微粒体中含有P450酶等主要参与药物体内代谢的酶，应用肝微粒体孵育体系对化合物进行代谢稳定性研究能在很大程度上反映药物在体内的代谢速率。动物肝微粒体制备方法成熟、保存方便，是很好的酶源。人源的肝微粒体虽然目前在国内来源受限，但国外公司已能商品化提供不同性别的混合肝微粒体，为该部分研究提供了保证。

体外肝微粒实验与体内结果一致，也具有明显性别差异，体内外相关性好。而PG490在比格犬与人肝微粒的代谢均未显示出自身代谢的性别差异。两种动物代谢性别差异存在种属差异，PG490在大鼠体内代谢有显著性性别差异，而比格犬没有差异，两种动物代谢特点体内外相关性一致。

实验结果显示PG490在雌性肝微粒体中消除较慢(t1/2为69min)而雄性为21min，表明性别差异的原因在于代谢消除环节。药物代谢差异主要表现在生物利用度、分布、代谢和消除，差异的形成主要是由于性别造成的体重、血容量、胃排空时间、血浆蛋白水平、CYP活性、转运体的作用和清除率活性的差别[4]。尽管大鼠PG490直接静注给药后代谢存在显著的性别差异，但药物在人体内代谢的性别差异远没有啮齿类动物那样明显， 而且至今还没有发现人类在酶亚型的表达上存在性别差异， 人体代谢上的差异更可能是遗传、环境和饮食等因素造成的个体间差异的结果。因此，根据动物体内外代谢性质相关性好和人源材料体外实验结果初步推测，以及考虑到PG490主要的代谢酶CYP3A4性别差异不显著，因而推测人体中MC002代谢不一定存在性别差异。