响应面优化普鲁兰酶酶解玉米淀粉工艺研究

曹川 解鹏

摘 要：研究普魯兰酶对蜡质玉米淀粉脱支工艺的影响. 以还原力（DE）为考察指标，探讨pH、温度、加酶量和酶解时间对玉米淀粉脱支的影响，采用响应面法对酶解过程中的工艺参数进行优化.研究结果表明，在玉米淀粉脱支工艺单因素试验中最适的酶解条件是：pH 5.0，温度50℃，加酶量7.2 U/g，酶解时间12 h;最佳酶解条件为：pH 5.3，加酶量8.1 U/g，温度50℃.最佳条件下得到的 DE为0.57，较单因素试验的DE高，证明此优化条件能较好地提高蜡质玉米淀粉的脱支程度.

关键词：普鲁兰酶;脱支;响应面

[中图分类号]TS234 [文献标志码]A

Response Surface Methodology for Optimization of HydrolysisConditions for Corn Starch by Pullulanase

CAO Chuan1，2，XIE Peng3

（1.College of Tea and Food，Anhui Agricultural University，Hefei 230001，Anhui，China;2.Department

of Grain Engineering，Anhui Vocational College of Grain Engineering，Hefei 230011，Anhui，China;

3.Nanjing University of Finance and Economics，Collaborative Innovation Center for Modern

Grain Distribution and Safety，Nanjing 210046，China）

Abstract：To research the effect of pullulanase on waxy corn starch debranching process.The effect of enzyme dosage，pH，temperature and time on the enzymatic hydrolysis of waxy corn starch was investigated with the release rate of reducing sugar （ DE） as the index.The response surface methodology was used to optimize the process parameters in the enzymolysis process.Results：The optimum enzymolysis conditions of waxy corn starch pulullanse content of 7.2 U/g，temperature55℃，enzyme solution pH 5.0，enzymatic hydrolysis time 12 h;Response surface analysis determined the optimal enzymatic conditions were pH 5.3，the amount of enzyme added 8.1 U/g and the temperature 50 ℃.Under the optimal conditions DE is 0.57，which is higher than that of the single factor test.It is proved that this optimization condition can better improve the debranching degree of waxy corn starch.

Key words：pullulanse;debranched;Box-Behnken

普鲁兰酶（Pullulanase， EC 3.2.1.41）是一种脱支酶，作为外切酶，能够专一性的切割葡萄糖的α-1，6糖苷键，应用于淀粉的脱支.脱支程度的增加使链重新结合形成新的晶体结构，从而形成更多的抗性淀粉.[1]Berry[2]报道了用普鲁兰酶对马铃薯支链淀粉进行脱支处理，使其RS3含量显著增加.Selime Mutlu[3]利用响应面法（RSM）模拟脱支和微波辐照对高直链玉米淀粉性能的影响，将微波处理和酶改性方法与RSM模型相结合，有助于确定高抗性淀粉（RS）含量和低体外血糖指数值的最佳处理点.本文以蜡质玉米淀粉为原料，通过普鲁兰酶进行淀粉脱支工艺研究，确定最佳的酶解条件，通过脱支生成线性短链淀粉，改善淀粉凝胶性能，提高分子聚集缠结能力和淀粉抗酶解能力，增强淀粉的流动性和压实性能，为淀粉基包埋产物缓慢释放提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

材料 玉米淀粉，苏州君世科技化工科技有限公司.

仪器 LP202A型電子天平（江苏常熟市衡器厂），超声波清洗机（昆山超声波仪器）;恒温水浴（杭州惠尔仪器）， TLXJ-IIC台式冷冻高速离心机（上海安亭科学有限公司），T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），DF-1集热式磁力搅拌器 （上海汗诺仪器有限公司），HY-5型振荡器（常州国华仪器设备公司）.

试剂 氢氧化钠、葡萄糖、碘液、无水乙醇、二甲基亚砜、苯酚、二硝基水杨酸、酒石酸钾纳、亚硫酸氢钠等，购自上海国药集团.普鲁兰酶，美国Sigma 公司.

1.2 脱支淀粉的制备

脱支淀粉的制备参考 Cai 和Liu的方法.[4]将一定质量的蜡质玉米淀粉置于500mL 0.01mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.0）中，制备10%乳液，磁力搅拌器在95℃条件下搅拌30min.调节pH，高压蒸汽121℃，30min，完全糊化.置于沸水浴中搅拌10min，当淀粉糊的温度降至50℃时，加入普鲁兰酶进行脱支12h.脱支结束后，100℃煮沸灭酶10min，无水乙醇定容至1 000mL.离心机离心收集沉淀物，冷冻干燥，过筛100目，最后得到脱支的蜡质玉米淀粉.

1.3 测定项目及分析方法

单因素试验 淀粉的脱支程度由还原力DE值决定，采用二硝基水杨酸法（DNS）在540nm处测量样品的吸光度.以DE为衡量指标，分别对加酶量、pH、温度和酶解时间进行试验测定，得出各个因素对蜡质玉米淀粉DE的变化趋势图.

酶解工艺条件的优化及响应面分析 为获得蜡质玉米淀粉最佳脱支条件，对酶解条件进行优化，根据单因素试验结果确定因素水平，通过Box-Behnken试验设计确定最佳工艺条件.

酶解优化试验因素和水平 通过中心复合试验设计对温度、pH和酶用量三个因素进行优化.以脱支后上清液中DE的变化作为响应值，三个自变量pH、温度和加酶量分别用A，B，C代表，结果见表1.采用origin8.0软件对数据进行处理，作折线图进行比较，用SPSS22.0软件对数据进行统计学分析，显著水平为P<0.05.

2 结果与分析

2.1 蜡质玉米淀粉脱支单因素试验结果与分析

普鲁兰酶用量对蜡质玉米淀粉脱支程度的影响 10%的蜡质玉米淀粉溶液糊化完全，调节pH为5.0，分别加酶量1.8，3.6， 5.4，7.2，9.0U/g，置于50℃下酶解12h.结果见图1.由图1可知，当普鲁兰酶添加量较少时，分子被切断程度不够，淀粉未完全脱支;添加量太大，蜡质玉米淀粉已经基本酶解完全，底物已经耗完，再增加酶用量对DE值的影响不大.考虑到经济效益和酶解效果，选择加酶量为7.2U/g.

pH对蜡质玉米淀粉脱支程度的影响 10%的蜡质玉米淀粉溶液糊化完全，加酶量为7.2U/g，分别调节pH为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，置于50℃水浴下酶解12h.结果见图2.酶与底物的结合能力和催化能力受到pH影响，由图2可以看出，pH4.0～5.0时DE值随着pH的上升而增加，pH大于5.0后，DE值反而随着pH值的升高而下降.因此，酶解的最适宜pH是5.0.

温度对蜡质玉米淀粉脱支程度的影响 10%的蜡质玉米淀粉溶液糊化完全，调节pH为5.0，加酶量为7.2U/g，分别置于45，50，55，60，65℃水浴下酶解12h.结果见图3.图3表明，最佳反应温度是50℃，温度会影响酶的催化效率[5]，普鲁兰酶作用温度过高过低都不利于淀粉的脱支.在45～50℃随着温度增加DE值增加，超过50℃，随着脱支温度的增加，普鲁兰酶的活性降低或者因过高温度普鲁兰酶失活，DE下降.

酶解时间对蜡质玉米淀粉脱支程度的影响 10%的蜡质玉米淀粉溶液糊化完全，调节pH为5.0，加酶量为7.2U/g，置于50℃水浴下分别酶解3，6，9，12，24，48h.结果见图4.由图4可知，随着酶解时间的延长，酶与底物的接触和反应越来越充分，普鲁兰酶作用时间在0～24 h曲线上升，普鲁兰酶作用时间为12h时，曲线上升到最高点.酶是缓慢作用于支链淀粉专一切开α-1，6糖苷键，脱支时间大于12h时，蜡质玉米淀粉的支链部分已基本被切开，蜡质玉米淀粉的脱支程度不再随着时间的增加而显著增加.

2.2 响应面优化结果与分析

利用Design Expert 8.0对试验进行处理分析，回归方程的方差分析、参数估计及显著性分析结果见表2.

利用Design Expert 8.0软件对数据进行二次多元回归拟合方程：

还原力DE=55.04-0.79*A+0.61*B+1.51*C+0.15*A*B+7.500E-003*A*C-0.39*B*C-5.61*A²-3.86*B²-7.15* C².

二次回归模型的F值为127.73，P<0.000 1，

大于在0.01水平上的F值;失拟项的F值为3.22，失拟项不显著，说明该模型拟和结果好，BC的交互作用对DE有显著的影响.模型与试验拟合效果较好，可用于对试验结果进行分析.利用Design Expert 8.0软件对数据进行二次多元回归拟合，得到的二次回归方程的响应曲面图[6]见图5-7.

由图5可知，pH和温度增加时，DE先升高后降低，等高线形状椭圆形，pH与温度的交互作用对反应有显著影响.[7]由图6和图7可知，还原力DE先匀速上升后迅速下降，响应面比较陡峭，说明DE对加酶量、温度、pH的变化敏感.为了进一步求得各因素的最佳条件组合，通过对模型方程的求解，得到曲面的最大值.对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即3个主要因素的最佳水平值，转换后得到提取的最佳条件为A=5.34，B=49.86，C=8.18.为检验响应曲面的可靠性，采用上述优化条件进行试验[8]，对试验结果进行验证.考虑到实际操作的便利，将酶解工艺参数修正为：pH5.3，温度50℃，加酶量8.10U/g，该条件下得到的DE分别为0.572 4，0.571 3，0.570 1，0.572 3，0.571 9，0.572 1，平均值为0.571 7，偏差不大，保持在0.57的水平，证明该结果是合理可靠的.

3 结果与讨论

采用单因素试验，确定酶解的pH、时间、温度和加酶量的最优条件.通过响应曲面法的优化，证明DE与3个关键因子（加酶量，温度，pH）的二次多项回归模型是合理可靠的.利用Design Expert软件对关键因子及其相互作用进行分析，得出酶解最佳条件：pH为5.3，加酶量为 8.1U/g，温度为 50℃，该条件下得到的蜡质玉米淀粉的还原力0.57以上.该研究可以为有效科学地利用淀粉脱支工艺将脱支淀粉应用于包埋运载药物及活性物质等，提供重要的技术基础.

参考文献

[1]Lin J-H，Chang Y-H.Effects of type and concentration of polyols on the molecular structure of corn starch kneaded with pullulanase in a Farinograph[J].Food Hydrocolloids，2006（20）：340-347.

[2]Berry CS.Resistant starch：Formation and measurement of starch that survives exhaustive digestion with amylolytic enzymes during the determination of dietary fibre[J].Journal of Cereal Science，1986（4）：301-304.

[3]Selime Mutlu，Kevser Kahraman，Sebnem Severcan，Serpil O··ztürk.Modelling the Effects of Debranching and Microwave Irradiation Treatments on the Properties of High Amylose Corn Starch by Using Response Surface Methodology[J].Food Biophysics，2018（9）：263-273.

[4]Liming CAI，Yong-ChengSHI，Lixia RONG et al.Debranching and crystallization of waxy maize starch in relation to enzyme digestibility[J].Carbohydrate Polymers，2010，81（2）：385-393.

[5]弥春霞，代志平，杨蕾. 酸奶中嗜热链球菌的分离及鉴定[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2007（3）：35-36.

[6]曹川，包建強.响应面法优化微波辅助提取贻贝蛋白的工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（5）：258-261.

[7]王茜，王啟之，时维静，等.响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较[J].安徽科技学院学报，2015，29（5）：24-31.

[8]黄艳胜.温度对玉米种子萌发能力的影响[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2007（1）：23-24.

编辑：琳莉

收稿日期：2019-12-01

基金项目：安徽省科技攻关项目（1704a07020098）; 2016年高等学校省级质量工程项目（ 2016jxtd038）

作者简介：曹川（1988-），女，安徽肥西人.讲师，博士，主要从事粮食储藏与检测科研;解 鹏（1988-），男，安徽肥西人.博士，主要从事粮食流通领域研究.