基于单壁碳纳米管的化学-光热协同治疗去势抵抗性前列腺癌的研究

宋绪佳，张时君，吕文鑫，黄 林，张 言，吴明贵#，谢少伟#

1.广西壮族自治区柳州市工人医院，广西医科大学第四附属医院泌尿外科，柳州545005；2.上海交通大学医学院附属仁济医院超声医学科，上海200127

前列腺癌是男性泌尿生殖系统较常见的恶性肿瘤[1-2]，内分泌治疗后大部分会转变为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），其预后较差。多西他赛（docetaxel，DTX）是CRPC一线化学治疗（化疗）药物，然而随着治疗的进行，大部分患者对其产生抗性[3-4]。因此，如何解决CRPC对DTX的耐药问题引起了广泛关注[5-6]。快速发展的纳米技术为我们提供了一个很好的药物递送手段[7-8]，解决了一些疏水药物难溶解、多种药物具有不同药代动力学行为的问题。并且由于纳米载体本身的特性，一些新兴治疗手段也应运而生，如光动力治疗、光热治疗及基因治疗等[9-13]。光热治疗利用光敏剂的高效光热转换效率，实现局部、非入侵式、选择性杀死被光吸收剂纳米颗粒结合并暴露在近红外光下的靶细胞，并在多种肿瘤模型中表现出了巨大的治疗潜力[14-15]。当药物负载到作为光敏剂的纳米载体后，还可实现靶向给药、精准释放的目的，从而降低化疗药物在非靶点的系统毒性。然而纳米材料由于其粒径较大（数十纳米至数微米），当其通过静脉给药后，大多数纳米载体可被内皮网状系统（reticular endothelial system，RES）识别，从而降低了纳米材料的靶向效率。而聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰后的纳米材料一定程度上可以避免被RES所捕获，而增加其血液循环时间，进而通过实体瘤组织中血管的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）增加了药物纳米载体的靶向效率。近几年，大量临床前研究[16-17]表明，纳米载体本身带来的光热治疗方式往往与常规化疗起到协同抑瘤的作用，而使得肿瘤耐药性得到改善，很大程度上改善患者的预后及治疗效果。因此，以纳米载体为基础，探讨光热治疗与化疗协同的抑瘤机制，增敏化疗效果，在临床上具有重要的意义。本研究以被截短的单壁碳纳米管（shorten singlewalled carbon nanotubes，s-SWCNTs）为载体，并将DTX负载到其表面后，探讨化疗和光热对CRPC细胞系C4-2的协同杀伤作用及体内抑瘤效果。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物

C4-2细胞由上海交通大学医学院附属仁济医院干细胞中心提供。Balb/c裸鼠购于上海斯莱克动物实验中心（Slac Laboratory，中国），生产许可证号为SCXK（沪）2017-0005，在（20±2） ℃、（60±10） %相对湿度、12 h光照/黑暗循环的标准条件下进行饲养。所有动物实验均按照实验动物管理条例规定进行，并经上海交通大学医学院动物保护与护理委员会批准，动物使用许可证号为SYXK（沪）2016-0009。

1.2 材料与试剂

单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）纯度＞95%，购于中国科学院成都有机所有限公司；PEG购于Polyvivo公司（美国）；DTX纯度＞99%，购于USP公司（美国）；体外培养所需的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、PRMI-1640培养基及青链霉素混合液购于Gibco公司（美国）；CCK-8试剂盒购于日本同仁公司；透析袋，截留相对分子质量为3 500，购于上海国药集团；实验中所涉及的化学试剂，如乙醇、浓H2SO4、浓HCl等均为分析纯，购于上海国药集团。

1.3 主要仪器

CO2恒温培养箱（美国Thermo公司），倒置荧光显微镜（日本Leica公司），紫外分光光度仪Lambda 950（美国PerkinElmer公司），冷冻离心机（美国Thermo公司），酶标仪SpectraMax M5（中国美谷分子仪器有限公司），红外热像仪（美国菲力尔公司），高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），傅里叶变换红外光谱（瑞士梅特勒-托利多公司），Zeta电位仪（英国马尔文公司），自动电导滴定仪（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.4 DTX@s-SWCNTs/PEG的制备与表征

1.5 DTX@s-SWCNTs/PEG的体外释药行为

上述制备的DTX@s-SWCNTs/PEG（1 mg SWCNTs，1.23 mg DTX）重新溶解在pH值为6.5的0.5 mL磷酸缓冲溶液（PBS）中（含10%吐温），转移至透析袋后（截留相对分子质量3 500），并将其放入20 mL相同pH值的PBS中，以37 ℃、300 r/min的条件孵育48 h。在预定的时间点，收集200 μL溶液，并使用高效液相色谱法测定释放到样品中的DTX含量。为测定药物累积释放曲线，在每个采样点都用相同体积新鲜PBS（200 μL）替换样品。所有实验点采取3次平行试验进行数据统计及分析。

1.6 DTX@s-SWCNTs/PEG的体外光热行为

将制备的DTX@s-SWCNTs/PEG配制为一系列浓度的水溶液（0～100 μg/mL），在1 W/cm2功率密度的808 nm激光照射下，通过红外热像仪来检测溶液温度的变化。为监测纳米系统的光热稳定性，将30 μg/mL的DTX@s-SWCNTs/PEG溶液置于功率密度为2 W/cm2的激光下辐射3 min后，关闭激光，室温恢复5 min，循环3次以观察溶液温度变化趋势，并绘制出温度-时间函数关系曲线。

1.7 DTX@s-SWCNTs/PEG的体外毒性研究

将C4-2细胞培养于96孔板中，每孔细胞为2×103个，培养24 h后，进行如下操作：①为了检测纳米系统的生物安全性，将含不同浓度的s-SWCNTs/PEG的完全培养液（0～100 μg/mL）加入到培养的细胞中，再孵育24 h后，用PBS清洗3次，再加入含CCK-8检测液的新鲜培养液后在37 ℃培养箱培养1～3 h，随后用酶标仪检测细胞的吸光度值，与未添加材料细胞的吸光度值进行比较，来确定细胞的活性。②为了检测光热特性对细胞的潜在毒性，经过上述相同的操作后，用1 W/cm2功率密度的激光每孔照射5 min，更换新鲜培养基，再孵育24 h后进行CCK-8检测，来确定细胞的活力。③为了评估化疗药物DTX及DTX协同光热对C4-2的毒性，将负载DTX的DTX@s-SWCNTs/PEG以上述相同的浓度及培养条件进行实验，不经过光照和经过光照处理（1 W/cm2每孔照射5 min），再孵育24 h后，进行细胞活性评价。绘制细胞活性与材料浓度相关曲线。

1.8 DTX@s-SWCNTs/PEG的体内抑瘤效果评估

2 结果

2.1 DTX@s-SWCNTs/PEG的表征

原始SWCNTs表面电位呈电中性，而经过混酸60℃处理6 h后，电位急剧下降到（-31.3±0.9） mV（图1A），通过自动滴定仪测试结果得到每克SWCNTs所含-COOH的量为0.412 mol（图1B）。傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared，FTIR）谱图中，约1 800 cm-1处 的C=O伸缩振动峰表明-COOH成功引入（图1C）。而此时SWCNTs的长度由原来的5～30 μm截短为1～3 μm（s-SWCNTs）。为进一步改善s-SWCNTs在体内的生物相容性，氨基封端的PEG（相对分子质量30 000）通过酰胺键与s-SWCNTs表面引入的-COOH进行反应，而使得PEG成功地负载到s-SWCNTs的表面（s-SWCNTs/PEG），此时，Zeta电位上升至（-17.3±0.8） mV（图1A）。最后通过纳米沉淀法使DTX的芳香结构与s-SWCNTs的疏水表面形成π-π堆积而将化疗药物DTX负载到s-SWCNTs上[18]。通过紫外-可见光吸收光谱可见，s-SWCNTs在约250 nm处形成新峰，表明DTX被成功地负载（图1D）。最终DTX@s-SWCNTs/PEG表面电位为（-10.3±1.5） mV，且在水溶液及生理环境中表现出很好的稳定性。

图1 DTX@s-SWCNTs/PEG的制备及表征Fig 1 Preparation and characterization of DTX@s-SWCNTs/PEG

2.2 DTX@s-SWCNTs/PEG的体外载药与释药行为

体外载药实验结果表明，随着DTX的喂料比增加，DTX在s-SWCNTs上的负载量也逐渐增加（图2A）。最终，每毫克s-SWCNTs可负载1.35 mg DTX。考虑到药物大量负载会增高纳米系统的电位，而使得在生理环境中变得不稳定，因此，本实验采用1 mg SWCNTs负载1.23 mg DTX的纳米系统为最终研究对象。通过高效液相色谱检测DTX@s-SWCNTs/PEG在pH 6.5的PBS中的释药行为来模拟纳米系统在肿瘤酸性条件下的药物释放行为（图2B）。实验结果表明，纳米系统在12 h内快速释放，并且在24 h内药物释放可高达（56.4±3.2） %，这种酸性释药行为也有利于DTX@s-SWCNTs/PEG在体内对肿瘤的抑制。

图2 DTX@s-SWCNTs/PEG的体外载药（A）与释药（B）Fig 2 Drug loading (A) and release (B) profiles of DTX form DTX@s-SWCNTs/PEG

2.3 DTX@s-SWCNTs/PEG的体外光热性能评估

由于SWCNTs在近红外Ⅰ区域表现出强的吸收（图1D），而赋予材料强的光热性能，从而可使材料作为理想的光热治疗剂。因此，我们在体外首先评价了s-SWCNTs/PEG纳米系统在808 nm激光辐射下的热性能。当激光以2 W/cm2的功率密度辐射30 μg/mL的纳米系统时，红外热像仪表明s-SWCNTs/PEG水溶液被快速地加热（图3A）。仅辐射3 min就可使体系最高温升至（52.6±0.8） ℃；辐射10 min后，体系温度高达（60.7±1.6） ℃。进一步探讨体系温度与辐射时间关系的实验表明，在1 W/cm2的激光功率密度下，随着纳米载体系统浓度的增加（10～100 μg/mL），其温度也逐渐升高（图3B）。最后，材料的光热稳定性能结果表明，高浓度的纳米载体（30 μg/mL）在高光照功率密度（2 W/cm2）循环照射下，材料热性能并未发生变化。每次光照循环下，材料都能达到最大的温度，且关闭激光后，系统也能在一定时间内恢复至室温（图3C）。

图3 DTX@s-SWCNTs/PEG体外光热性能表征Fig 3 Photothermal performance of DTX@s-SWCNTs/PEG in vitro

2.4 DTX@s-SWCNTs/PEG的体外细胞毒性评价

CCK-8实验结果表明，光热、化疗对C4-2细胞表现出协同杀伤作用（图4）。而不同浓度的材料与C4-2共培养24 h的结果表明，材料没有表现出明显的细胞毒性（图4A）[19]。受到激光辐射后（1 W/cm2，5 min），材料展现出明显的细胞毒性，且随着浓度进一步增加，细胞活性逐渐降低。化疗药物毒性监测实验表明，负载到s-SWCNTs的DTX的毒性高于游离的DTX药物（图4B），进一步进行光照处理，其细胞活性进一步下降。即使在较低的材料浓度下（5 μg/mL），联合治疗也表现出较高的细胞毒性，此时细胞存活率只有（43.2±5.7） %。这些实验结果表明负载DTX的s-SWCNTs纳米系统表现出协同的化疗-光热杀伤作用，可进一步用于负瘤小鼠的光热-化疗协同治疗。

图4 DTX@s-SWCNTs/PEG对C4-2细胞的协同化疗-光热体外毒性表征Fig 4 Synergetic chemo-photothermal combination therapy with DTX@s-SWCNTs/PEG in C4-2 cells

2.5 DTX@s-SWCNTs/PEG的体内协同抑瘤作用

评估材料体外协同抑制C4-2细胞的生长后，进一步评估了其体内协同抗瘤效果。s-SWCNTs/PEG纳米复合物静脉注射荷瘤小鼠24 h后，进行光照处理。红外热像仪数据表明，当小鼠肿瘤暴露于2 W/cm2的光照功率密度下，肿瘤部位温度迅速上升，仅照射5 min，肿瘤温度高达65.7 ℃（图5A）。为避免对正常组织造成损伤，实验中选择适度的光照功率密度（1 W/cm2）对肿瘤部位光照5 min，作为肿瘤的最佳光照条件。此时，肿瘤温度保持在约50 ℃。多种处理方式治疗后，对小鼠肿瘤体积监测表明（图5B），化疗对肿瘤有轻微的抑制作用，光照组虽然能较快地消融原发瘤，但在治疗2周后肿瘤复发；而联合组对肿瘤的抑制效果最明显，且在3周的实验观察期没有发现肿瘤复发。小鼠的体质量实验监测结果表明，s-SWCNTs/PEG和DTX@s-SWCNTs/PEG纳米系统在体内并没有表现出明显的毒性（图5C）。综合上述结果表明，负载DTX的s-SWCNTs纳米系统在体内表现出协同的抑制前列腺癌的作用，可避免单一治疗的不足及化疗药物产生的抗药性。

图5 体内化疗-光照协同抑瘤作用评价Fig 5 Synergetic therapeutic effect of chemo-photothermal therapy

3 讨论

CRPC在临床上往往以化疗药物（如DTX）为主，而单一化疗往往效果不理想，且长时间、大剂量用药后，肿瘤表现出抗性。而光热治疗可选择性地对肿瘤进行杀伤，大量临床前实验结果[14-18,20]表明，热处理可在一定程度上增敏化疗效果，所以将光热和化疗药物联合，在临床上具有巨大潜力。由于SWCNTs自身独特的性能，可以将2种治疗方式有机地结合起来。一方面，SWCNTs的高比表面积及疏水表面使其在载药方面表现出优异的特性[20-22]；另一方面，自身高效的光热转换效率也使其成为理想的光热治疗剂[17,23-24]。因此本研究以SWCNTs为药物载体，在体内、外评价了光热-化疗协同抑制CRPC的潜力。

原始SWCNTs的长度限制了其在生物体内的应用，经过截短后，其尺寸有利于体内通过EPR效应在肿瘤内部富集。PEG修饰可避免其被RES吞噬，而增加其血液循环时间[25-26]。酸响应释放药物的行为，一定程度上降低化疗药物对正常器官的毒性；与游离DTX相比，这种靶向递送、精准释放使得DTX@s-SWCNTs/PEG纳米系统表现出体内应用优势。对C4-2荷瘤小鼠治疗结果同样表明了光热-化疗协同作用的优势，DTX@s-SWCNTs/PEG纳米系统不仅能快速地消融肿瘤，还避免了肿瘤的复发。并且这种基于s-SWCNTs的化疗-热疗联合模式治疗，在本研究中的剂量下（静脉注射10 mg/kg），表现出高的生物相容性。

总之，由于SWCNTs独特的物理结构及高效的光热转化性能，不仅使其可作为理想的药物载体，还可作为强有力的光热治疗剂。当DTX以1.23:1（质量比）的比例负载到PEG修饰的s-SWCNTs后，纳米系统同时拥有化疗及光热治疗特性。体外释药行为表明，DTX可在酸性环境中快速地从纳米载体上释放出来，这有利于肿瘤酸性环境中的释药行为。纳米系统在体外对C4-2细胞表现出化疗-光热协同的杀伤作用，并且在体内成功消融C4-2移植瘤模型小鼠的肿瘤，避免单一疗法带来的不足，且成功阻止了肿瘤的复发。综上，本实验结果表明，基于SWCNTs的化疗-光热协同治疗系统具有抑制前列腺癌的巨大潜力，可显著增敏化疗药物疗效，为前列腺癌的治疗提供了新方向。