胶乳增强免疫比浊法检测血清25-羟维生素D的性能验证

刘 琴，王玲萍，陆仁伟，陆茜莹，许 中

(1.苏州市相城区漕湖人民医院检验科，江苏 苏州 215144；2.苏州市立医院东区检验科，江苏 苏州 215001）

维生素D（Vitamin D, VD）是一种脂溶性固醇类物质，是人体必需维生素，主要以麦角钙化醇（维生素D2）和胆钙化醇（维生素D3）两种无活性形式存在，人体不能自身合成，需通过紫外线照射皮肤合成或者直接从植物中摄取[1]。VD的主要生理作用是维持机体钙磷代谢，进而保证骨骼健康，VD缺乏或不足可导致佝偻病、软骨病等骨骼系统疾病，还与自身免疫性疾病、心血管疾病、抑郁症、糖尿病等疾病关系密切[2-6]，因此，VD缺乏已经成为一个全球公共卫生问题，VD检测也日益成为临床检验关注焦点。VD在体内经25羟化酶催化合成25-羟维生素D[25(OH)D]，再经25(OH)D-1α羟化酶催化成1,25(OH)2D，后者是VD发挥其生理作用的主要活性物质，但是其含量极少，半衰期短，且受血钙、磷和甲状旁腺激素（PTH）水平的影响[7]，而25(OH)D是VD的主要储存形式，能充分反映体内VD总量和转化能力。因此，血清总25-羟维生素D被认为是评估体内VD状态的最为有效的指标。

本研究旨在通过对苏州博源医疗科技有限公司（以下简称“苏州博源”）生产的总25-羟维生素D检测试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）进行方法学性能评估，并通过与罗氏诊断（上海）产品有限公司（以下简称“罗氏诊断”）代理的进口产品25-羟维生素D检测试剂盒（电化学发光法）进行方法学比对，评价两者之间的一致性。

1 材料与方法

1.1 样品来源

1.1.1 试剂性能验证样品：(1)正确度评估试验样品：选择低、中、高值血清样品，每个样品分别加入一定体积的25-羟维生素D3标准溶液（北京中科），制成待回收分析样品。(2)精密度评价试验样品：低值和高值血清样品。(3)线性评估试验样品：选择低值和高值两个浓度的血清样品，按比例配制成不同梯度的线性评估样品。(4)灵敏度评估实验样品：纯水和低浓度血清样品。以上血清样品均来自2019年5月—10月苏州市立医院东区检验科血清样本，样品收集后在我－20 ℃下冻存。

1.1.2 方法学比对验证样品：选取苏州市立医院东区2019年5月—10月无溶血、脂血、黄疸新鲜血清样品110 例，样品收集后在－20 ℃下冻存。

1.2 主要仪器与试剂 7600全自动分析仪（日本日立公司）。总25-羟维生素D试剂及其配套校准品和质控品分别来自苏州博源和罗氏诊断公司，批号分别为191213和191210，前者为试验试剂，后者为参比试剂。按照制造商提供的说明书设置相应参数，并按照标准化操作程序完成校准和质控。

1.3 方法

1.3.1 正确度：选择3个不同浓度水平的血清样品，分别在血清样品（浓度C0，体积V0＝0.9 mL）中加入一定量的标准溶液（浓度Cs＝150 ng/mL，体积V＝0.1 mL），配制成待测回收样品（浓度C）。每个样品重复测定3 次，计算每个样品的回收率（R），计算公式：R（%）＝[C×(V＋V0)－C0×V0]/(Cs×V)×100%[8]。

1.3.2 精密度：参考CLSI EP15-A文件方案[9]，选取低值和高值两个浓度的血清样品连续进行5 d的测定，每日一个批次，每个样品重复测定4 次。

1.3.3 线性范围：参考CLSI EP6-A文件方案[10]，将低水平混合血清（ L：8 ng/mL）和高水平混合血清（ H：152 ng/mL）按照比例L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、H进行稀释，配制成6个梯度的混合血清。各浓度梯度混合血清测定2 次，以预期浓度为X轴，实测浓度为Y轴绘制散点图，计算回归方程和R2，通过EP软件进行统计分析。预期浓度计算公式：X＝(CL×VL＋CH×VH)/(VL＋VH)。其中：CL：低水平混合血清样品的浓度，VL：低水平混合血清样品的体积，CH：高水平混合血清样品的浓度，VH：高水平混合血清样品的体积。

1.3.4 分析灵敏度：参考CLSI EP17-A方案[11]，在同一批内连续测定空白样品纯水和低浓度样品各20 次，记录测定结果。计算空白检测限（limit of blank, LOB）和分析灵敏度（limit of detection,LOD）。空白样品的测定值以不超过3个大于厂商声明的LOB（1.2 ng/mL）认为结果可接受；低浓度样品测定结果中以不超过5%（1个）小于厂商声明的LOD（2.9 ng/mL）认为分析灵敏度符合要求。

1.3.5 临床样品比对：选取本院2019年5月—10月无溶血、脂血、黄疸的新鲜血清样品110 例，分别用苏州博源和罗氏诊断的25-羟维生素D试剂进行检测，比对试验统计根据MedCalc软件中方法比对和评估进行。

1.4 统计学分析 所用统计量及统计图表均由MedCalc分析软件计算绘制。

2 结果

2.1 正确度 低、中、高浓度血清样品的回收率分别为106.2%、102.3%、99.8%，在生产厂商声明的范围内，结果见表1。

表1 正确度评估试验结果

2.2 精密度 低值血清样品的批内精密度为2.87%，小于厂商声明的1/4TEa（6.25%），总精密度为3.60%，小于厂商声明的1/3TEa（8.33%）；高值血清样品的批内精密度为1.42%，小于厂商声明的1/4TEa（6.25%），总精密度为2.09%，小于厂商声明的1/3TEa（8.33%）。

2.3 线性范围 该试剂在8.0～152.0 ng/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y＝－2.5853＋1.0410X，R2＝0.996。散点图见图1。

图1 线性范围散点图

2.4 分析灵敏度 测定结果中符合条件的空白样品的测定值个数为20个，所有低浓度样品测定结果均大于厂商声明的LOD，因此该试剂的分析灵敏度符合要求。

2.5 临床样品比对 Deming回归图见图2，回归方程的截距（intercept）和斜率（slope）分别为－2.59（95%CI：－3.81～－1.37）和1.04（95%CI：0.98～1.11），r为0.951，线性相关性良好。以苏州博源和罗氏诊断测定结果的均值为X轴，比值为Y轴绘制Bland-Altman图（见图3），结果显示，95%一致性界限为（0.43,1.33），有95.5%（105/110）的点落在一致性界限范围内，可见两种检测方法的检测结果一致性良好。

图2 Deming回归图

图3 Bland-Altman图

3 讨论

本文参照CLSI文件对苏州博源的总25-羟维生素D试剂正确度、精密度、线性范围、分析灵敏度等重要指标进行了评价。结果显示，采用回收实验验证试剂正确度符合厂商声明的可接受范围，低、中、高浓度血清样品的回收率分别为106.2%、102.3%、99.8%；低值、高值血清样品的批内精密度和总精密度分别为2.87%、1.42%和3.60%、2.09%，小于厂商声明的1/4TEa（6.25%）和1/3TEa（8.33%）；线性范围为8.0～152.0 ng/mL，符合厂商声明的范围；分析灵敏度符合厂商声明的值（2.9 ng/mL）；参考区间验证符合厂商声明的参考区间（＞30 ng/mL）。与同类产品罗氏诊断进行了方法学比对，结果一致性良好。试剂符合实验室质量要求，适用于实验室常规检测的开展。

目前，25-羟维生素D的检测方法有放射免疫法、酶免疫法、化学发光法、高效液相色谱法、胶乳增强免疫比浊法等[12-13]。免疫分析法原理是基于抗原抗体的结合，适用于全自动分析仪，操作简单，分析速度快，可实现高通量检测，只是不能区分维生素D2和D3，临床上一般用于检测总25-羟维生素D。LC-MS/MS被认为是公认的测定25-羟维生素D的金标准，敏感性高、特异性强。但是，目前市面上25-羟维生素D测定结果之间可比性较差，检测方法的一致性有待提高[1]。对于免疫法来说，不同厂家的试剂抗体交叉反应差异显著；LC-MS/MS方法则会受到3-表-25-羟维生素D的干扰，而且检测方法大多由实验室自主研发和验证，各仪器厂家方法间结果可比性差，方法的标准化也亟待解决，而且仪器价格偏高，对实验室条件及操作人员技术要求严格，所以不能广泛应用于大多数实验室。

随着社会经济发展和生活方式的改变，VD不足或缺乏的情况日渐普遍，而VD有着非常重要的生理作用，不仅在钙磷代谢和骨骼发育中至关重要，还与心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病、肥胖等疾病相关，因此，VD的检测值在各个实验室广泛推广和使用。25-羟维生素D作为VD在体内的主要储存物质可作为检测的最佳指标，但是，临床的应用需要解决很多问题，还有许多工作需要进一步完善，本研究也是笔者一直在不断深入探索的一部分，希望能为检验领域解决更多亟待解决的问题。