葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulata)六种化学成分近红外定量模型的建立

黄冠明，郭 香，祁剑飞，宁 岳，巫旗生，王晓清*，曾志南*，朱礼艳

1. 湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128 2. 福建省水产研究所，福建 厦门 361013 3. 福建安井食品股份有限公司中心实验室，福建 厦门 361028

引 言

葡萄牙牡蛎(Crassostreaangulata)又名福建牡蛎，属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、珍珠贝目(Pterioida)、牡蛎科(Ostreidae)、巨蛎属(Crassostrea)，其食物链较短、生长迅速、产量高，且经济效益好[1]，是福建省海水贝类养殖的主要种类。牡蛎味道鲜美，并富含蛋白质及多种微量元素，为人们提供了丰富的营养源，是一种深受欢迎的海产品。随着生活水平的提高，消费者更加看重牡蛎的营养和风味，选育营养好、口感佳的牡蛎新品种，在水产消费市场有着很大的需求。目前，葡萄牙牡蛎遗传育种的研究主要集中在种间杂交[2-3]，快速生长新品系和壳色新品种的选育等方面，曾志南等[4]通过连续数代的群体选育，培育出了金黄壳色速长葡萄牙牡蛎新品系，其生长速度明显高于普通群体，通过对该品系体成分的研究分析发现，该新品系水分、糖原、锌、铁的含量明显高于普通群体，高糖原含量的牡蛎普遍口感更佳，但新品系粗蛋白、钙的含量显著低于普通群体[5]，同时观测到，高铜、锌含量的葡萄牙牡蛎中牛磺酸的含量也明显较高。一直以来, 国内外都未见有关牡蛎肉质性状选育工作的报道，原因是对肉质性状进行选育时，需要对大量样本的成分指标进行检测分析，而传统的实验室化学检测方法存在耗时费力、成本高、污染环境等缺点[6]。

近红外光谱技术(near-infrared spectroscopy, NIRS)是一种敏感、高效、低成本、无污染的新型定量分析技术，能够对同一样本中的多项化学指标进行快速准确的预测，在食品[7]、医药[8]、选择育种[9]等方面有广泛的应用。目前，在水产育种领域，近红外光谱技术仅对长牡蛎(Crassostreagigas)中蛋白质、糖原的含量有较准确的预测[10]，但尚未见用于分析葡萄牙牡蛎生化成分的报道。本研究对105份采自4个时间段，6个产地的葡萄牙牡蛎样本进行冷冻干燥处理，避免牡蛎软体部高水分含量对近红外光谱分析的影响，建立了能够快速准确测定葡萄牙牡蛎中蛋白质、糖原、牛磺酸、锌、硒、钙6种体成分含量的近红外光谱模型，对今后选育肉质性状佳的葡萄牙牡蛎新品系提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 材料

自2018年6月至2019年3月，三个月为一间隔，分别从福建福州、石狮、诏安，广东汕头、湛江，广西防城港6个产地，共采集105份葡萄牙牡蛎样本。单个牡蛎软体部湿重(除去闭壳肌)为0.28～2.33 g, 根据开壳后牡蛎肉的大小，分为大个体样本组和小个体样本组，每份样本湿重30～50 g。

将新鲜葡萄牙牡蛎开壳，取软体部，用剪刀剪去闭壳肌后称重，按大小分组后放入50 mL离心管, 并将离心管置于冰盒中。先用剪刀将离心管中的牡蛎肉剪碎，然后用手持式匀浆机调至最大转速匀浆60 s，在-80 ℃冰箱中保存12 h后，使用真空冷冻干燥机干燥48 h。用研钵和研杵将干燥后的样本研磨至细粉末，然后用60目筛网筛分, 样本颗粒越均匀细小，越利于提高模型预测的准确度[12]。将每份样本分成两份，一份用于近红外光谱的采集，一份用于6种成分化学真实值的测定。

1.2 仪器

傅里叶近红外(NIR)光谱仪(Thermo Fisher，AntarisⅡ, USA)，采集软件RESULT-Integration(Thermo Fisher，USA)，数据分析软件TQ Analyst(Thermo Fisher，USA)，全自动凯氏定氮仪(FOSS，Kjeltec 8400, Sweden)，可见分光光度计(Shimadzu，UVmini-1240, Japan)，液相色谱仪(Shimadzu, LC-16, Japan)，火焰原子吸收分光光度计(Varian, AA240FS, USA), 双道原子荧光仪(北京吉天，AFS-930, China), 真空冷冻干燥机(CHRIST, Alpha 2-4 LDplus，Germany), 手持式匀浆机(IKA T10 basic ULTRA-TURRAX，Germany)。

1.3 光谱采集

近红外光谱仪开机预热30 min后, 将准备好的样品放入光谱仪配套的石英杯，样品厚度1 cm，将软件设置为漫反射光谱，光谱扫描范围在10 000～4000 cm-1，扫描次数为64次，分辨率为8 cm-1，吸收光谱用log(1/R)表示，其中R表示反射率。在采集每个样品之前，先采集背景光谱以消除背景所带来的影响。

1.4 化学真实值测定

葡萄牙牡蛎中蛋白质、牛磺酸、锌、硒、钙含量测定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》、GB 5009.169—2016《食品中牛磺酸的测定》、GB 5009.14—2017《食品中锌的测定》、GB 5009.93—2017《食品中硒的测定》、GB 5009.92—2016《食品中钙的测定》的方法，糖原含量测定采用试剂盒法(EnzyChromTM糖原试剂盒，BioAssay Systems，USA)。

1.5 模型建立与验证

采用TQ Analyst软件，选用偏最小二乘法(PLS)，以及乘法散射校正(MSC)、一阶求导、Norris平滑的光谱预处理方法，并选择软件自动推荐的波段范围，剔除异常样本。模型采用外部验证和交叉验证的方法对模型预测效果进行验证，验证样本数量为总样本数的1/3。

2 结果与讨论

2.1 化学成分测定结果

采用国标法和试剂盒法对105份葡萄牙牡蛎干粉样本的蛋白质、糖原、牛磺酸、锌、硒、钙含量进行测定。分析结果如表1所示，蛋白质含量分布范围为30.60%～68.00%，糖原3.00%～48.10%，牛磺酸7.80%～27.60%，锌0.11%～2.21%，硒1.36%～6.91%，钙1.09%～11.70%，可见样本中6种成分含量的分布范围广，有较强代表性，满足了近红外定量模型要求样本成分含量分布范围广的基本要求。

表1 葡萄牙牡蛎样本中蛋白质、糖原、牛磺酸、锌、硒、钙含量分析结果

Table 1 Statistics of protein, glycogen, taurine, zinc, selenium and calcium contents ofCrassostreaangulatasamples

蛋白质糖原牛磺酸锌硒钙最大值/%68.0048.1027.602.216.9111.70最小值/%30.603.007.800.111.361.09平均值/%51.6218.5216.250.742.693.19标准偏差/%9.0611.694.700.501.032.11总样本数105105105105105105

2.2 原始光谱分析

用近红外光谱仪采集了105份样本原始光谱，如图1所示，光谱曲线走向基本一致，但不同样本的光谱曲线又略有不同，说明各样本成分含量有差异。由于部分样本采集光谱时正处于南方梅雨季节，实验室湿度较大，导致采集的原始光谱在7 500～7 000和5 500～5 000 cm-1附近的水峰区域有噪声干扰，图谱质量受到了水汽影响。

图1 葡萄牙牡蛎样本的原始光谱图Fig.1 The raw spectra of Crassostrea angulata samples

2.3 预处理光谱分析

如图2所示，原始光谱通过乘法散射校正(MSC)、一阶求导、Norris平滑的光谱预处理方法，消除了由于样本颗粒大小等原因引起的光谱信号基线漂移及噪声等问题[12]，减少了图谱中的不均匀散射效应，提高了信噪比(SNR)。

图2 乘法散射校正、一阶求导结合Norris平滑Fig.2 MSC+1st derivative+Norris derivative filter

2.4 模型的确立和外部验证

选择TQ Analyst软件自动推荐的光谱波段范围(如表2)，建立了6种成分的近红外定量分析模型，并对模型进行了外部验证。

蛋白质定量模型的校正相关系数(RC)为0.985 3，校正均方根误差(RMSEC)为1.62，预测相关系数(RP)为0.985 1，预测均方根误差(RMSEP)为1.59(如图3)。

糖原定量模型的校正相关系数(RC)为0.965 1，校正均方根误差(RMSEC)为3.19，预测相关系数(RP)为0.963 6，预测均方根误差(RMSEP)为3.17(如图4)。

牛磺酸定量模型的校正相关系数(RC)为0.950 4，校正均方根误差(RMSEC)为1.14，预测相关系数(RP)为0.944 1，预测均方根误差(RMSEP)为1.05(如图5)。

锌定量模型的校正相关系数(RC)为0.955 4，校正均方根误差(RMSEC)为0.156，预测相关系数(RP)为0.946 1，预测均方根误差(RMSEP)为0.153。

硒定量模型的校正相关系数(RC)为0.920 0，校正均方根误差(RMSEC)为0.290，预测相关系数(RP)为0.919 0，预测均方根误差(RMSEP)为0.289。

图3 蛋白质化学真实值与预测值的相关关系图Fig.3 Protein chemical value and predictive valueof correlation diagram

图4 糖原化学真实值与预测值的相关关系图Fig.4 Glycogen chemical value and predictivevalue of correlation diagram

图5 牛磺酸化学真实值与预测值的相关关系图Fig.5 Taurine chemical value and predictive valueof correlation diagram

钙定量模型的校正相关系数(RC)为0.925 2，校正均方根误差(RMSEC)为0.929，预测相关系数(RP)为0.924 1，预测均方根误差(RMSEP)为1.03。

以上6个定量模型的校正相关系数(RC)均高于或等于0.92，预测相关系数(RP)均高于0.91，模型预测值与化学真实值有很高的的相关度，且校正均方根误差(RMSEC)和预测均方根误差(RMSEP)都在可接受范围，6个近红外定量模型都有着较好的预测效果，尤其蛋白质、糖原、牛磺酸、锌定量模型的预测效果特别令人满意。由此可见，此次建模适用于今后葡萄牙牡蛎体成分的实际检测。

2.5 模型的交叉验证

通过软件对6个模型进行了交叉验证，得到以下结果：

蛋白质定量模型的交叉验证相关系数(RCV)为0.981 7，交叉验证均方根误差(RMSECV)为1.81。

糖原定量模型的交叉验证相关系数(RCV)为0.946 1，交叉验证均方根误差(RMSECV)为3.95。

牛磺酸定量模型的交叉验证相关系数(RCV)为0.900 5，交叉验证均方根误差(RMSECV)为1.61。

锌定量模型的交叉验证相关系数(RCV)为0.897 5，交叉验证均方根误差(RMSECV)为0.233。

硒定量模型的交叉验证相关系数(RCV)为0.875 3，交叉验证均方根误差(RMSECV)为0.360。

钙定量模型的交叉验证相关系数(RCV)为0.829 2，交叉验证均方根误差(RMSECV)为1.39。

以上6个实验结果，交叉验证均方根误差(RMSECV)都在可接受范围，交叉验证相关系数(RCV)除了钙的结果不够理想，其余均高于0.87，预示模型有着较好的预测效果，但钙的近红外定量模型今后还有可优化空间。

3 结 论

实验样本采集时长9个月，葡萄牙牡蛎样本来自于6个不同产地，且样本量足够大，具有较好的代表性，样本经过冷冻干燥处理，减少了水分对光谱质量的影响，有利于提高模型的准确性及稳定性。实验所建立的6个近红外定量模型，有着较高的校正相关系数和预测相关系数，可见模型具有较好的预测效果，近红外光谱技术适用于葡萄牙牡蛎中蛋白质、牛磺酸、锌、硒、钙含量的检测。但钙定量模型的交叉验证相关系数稍低，还需对其进行优化，进一步提高其实际预测的准确性。

本模型的建立，对今后开展大规模葡萄牙牡蛎体成分的测定，选育肉质性状佳的葡萄牙牡蛎新品系有着重要意义。