新型冠状病毒实验室检查方法的应用现状及结果解读

吴 嘉,汪俊军

0 引 言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一种新型β属冠状病毒，属于单链RNA病毒，可引起2019年新型冠状病毒病(corona virus disease 2019，COVID-19)。该病具有高传染性、高隐匿性和高致病性，已纳入乙类传染病，按照甲类传染病管理。由于COVID-19为新发疾病，且疫情蔓延迅速，临床亟需快速、有效的方法以对不同病程患者及疑似患者进行明确地诊断。

现有SARS-CoV-2感染的实验室检查方法主要包括病毒分离、核酸检测、抗体检测以及其他血液学指标检测。其中病毒分离为实验室检查的“金标准”，但必须在生物安全三级的实验室内进行，且培养时间较长(约6 d)，故不适合COVID-19的快速筛查与诊断。其他血液学检查包括外周血白细胞、淋巴细胞计数以及血清肝酶、C反应蛋白等；但由于特异性有限，仅可作为参考。核酸检测是病原学检查的首要手段。SARS-CoV-2感染机体后，病毒的遗传物质RNA可被最先检测。随着感染病程的进展，机体对病毒进行免疫防御并产生特异性抗体。其中IgM是机体感染后早期产生的抗体，可提示现行感染或新近感染；IgG是再次免疫应答产生的主要抗体，提示病情进入恢复期或存在既往感染；IgM和IgG的联合检测不仅有助于疾病的诊断，还可对机体的感染阶段进行评估。

1 核酸检测的现况与应用评估

理论上，核酸检测是能最早确诊COVID-19的病原学检查手段。宏基因组新一代测序技术(metagenomics next generation sequencing, mNGS)是目前临床常用的病原体基因测序方法，具有灵敏度高、无偏性病原体广覆盖等特点，不仅可对SARS-CoV-2这类新发病原体进行鉴定，还可同时为其他病原体或混合感染的诊断提供依据。但由于mNGS价格昂贵，且对仪器设备及操作要求较高等原因，多数医疗机构均无法独立完成检测，难以实现大范围推广及快速诊断的目的。

在采用mNGS确定SARS-CoV-2核酸序列的基础上，可通过对保守区域进行引物探针设计，采用靶向实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-PCR)方法检测SARS-CoV-2核酸。目前，SARS-CoV-2核酸检测主要以病毒基因组中3段保守序列为靶标位点，即开放读码框1ab(open reading frame 1ab， ORF1ab)、核壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)和包膜蛋白(Envelop，E)基因作为检测靶标。2020年2月19日国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第六版)中指出，疑似病例必须有病原学阳性证据才可确诊，即RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性或者病毒基因测序与已知SARS-CoV-2高度同源[1]。2020年2月21日国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中强调，确诊病例需满足同一份标本中SARS-CoV-2的ORF1ab及N基因的2个靶标RT-PCR检测均为阳性，或2种类型标本的RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本2次采样的RT-PCR均出现单靶标阳性[2]。

然而，临床实践中并非所有COVID-19患者均可通过常规采样标本检测出SARS-CoV-2核酸。按照实验室检测技术指南的要求，每例疑似病例和聚集性病例均须采集急性期上呼吸道或下呼吸道标本；重症病例优先采集深咳痰液、肺泡或支气管灌洗液等下呼吸道标本[2]。但由于多数COVID-19患者咳痰及下呼吸道标本取样操作困难，且生物安全风险极大。因此，临床常规采集的呼吸道标本仍以鼻、咽拭子为主；而拭子样本采用现有RT-PCR试剂，阳性检出率仅为30%～50%，大量的“假阴性”结果无法避免[3]。目前，全国各地多家医疗机构均出现过SARS-CoV-2核酸检测“假阴性”的案例，甚至有的确诊病例先前的多次核酸检测均呈阴性，致使实验室检查与临床症状、影像学特征不相符，严重影响临床诊疗，甚至延误整体的疫情防控。

2 核酸检测“假阴性”原因

2.1 检测试剂的有效性 由于疫情形势的严重性和紧迫性，现有核酸检测试剂盒多数经国家药监局应急审批程序紧急批准上市，这种举措虽然有效地缓解了疫情防控工作中因检测试剂不足导致疑似病例无法尽早确诊的问题，但也因缺乏足够的时间对检测试剂进行先期临床试验，不可避免地存在部分产品的有效性难以保证。

2.2 采样方式与时机 为提高检出率，对于肺炎患者通常选取下呼吸道标本，从而获得更高的病毒载量。鼻、咽拭子作为最普遍的采样方式，其检出率与病毒感染的进程密切相关。以甲型流感为例，一般在发病24～72 h内，病毒在鼻、咽部的载量达到高峰，随后迅速下降。由于目前临床上对SARS-CoV-2感染后鼻、咽部采样的最佳时机尚无定论，尤其是个别病例潜伏期长，就诊时可能已经迁延数天甚至数周，是否为鼻、咽部采样的最佳时期，标本内病毒载量是否仍在检测阈值范围内均无法确定，从而造成检测的“假阴性”。

2.3 病毒变异可能 考虑到SARS-CoV-2属于不稳定、易变异的RNA病毒，针对其变异频率及突变热点等问题暂时难以进行大规模临床样本的验证，故存在个别病例扩增区突变而导致“假阴性”的可能。此外，现有核酸检测试剂盒大多靶向ORF1ab及N基因，不同双位点RT-PCR试剂对于N基因的扩增灵敏度普遍高于ORF1ab基因，且细胞内病毒N基因mRNA的拷贝数也远高于ORF1ab基因；但N基因的保守程度却不及ORF1ab基因，推测其为N基因单靶标阳性比例高于ORF1ab基因的原因。

2.4 标本保存与运输 RNA病毒稳定性差，标本通常须存放在专用保存液中，以4 ℃或以下温度保存，并尽快送检。由于多数医疗机构在标本采集后需送至各地疾控中心统一检测，或因检测单位人力、能力等问题造成个别标本从采样到实际检测可能已经超过了检测最佳时限，导致结果出现“假阴性”。

2.5 方法学因素 RT-PCR检测的影响因素较多，如标本核酸提取或纯化过程出现的扩增反应抑制物、扩增仪孔间温度差异等。操作对实验室人员技术要求较高。不规范操作可导致核酸提取效率与纯度不佳、RNA质量良莠不齐，均可导致“假阴性”结果。

目前，COVID-19最常用病原学检查仍然是采用RT-PCR技术的核酸检测，临床上对于核酸检测为阴性或单通道阳性的病例需谨慎对待，应充分考虑到各环节中可能造成结果不准确的因素。保证试剂盒质量、规范采样/保存/运输流程、提高实验室人员技术水平、优化检测流程等均可作为提高核酸检测准确性的有效手段，亦是目前疫情防控工作的关键。

3 抗体检测的价值与应用前景

随着核酸检测“假阴性”导致实验室检查与临床表征不一致问题的出现，COVID-19迫切需要可以弥补核酸检测“漏检”的其他方法。《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中，在强调病原学证据阳性的同时，也指明核酸检测阴性不能排除SARS-CoV-2感染，提出了采用血清样本进行SARS-CoV-2抗体检测的要求，对疑似病例的排除有一定指导作用[2]。2020年2月25日国家药监局器审中心制定了《2019新型冠状病毒抗原/抗体检测试剂注册技术审评要点》(试行)，对SARS-CoV-2抗原或抗体检测试剂的一般要求进行了明确[6]。2020年2月26日军队援鄂医疗队结合实践经验及部队医院的特点，制定了《军队支援湖北医疗队新型冠状病毒感染疾病诊疗方案》(试行第一版)，提出血清特异性IgM检测阳性可作为疑似病例的确诊依据[7]。2020年3月4日国家卫健委发布《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(第七版)，实验室检查中新增了血清SARS-CoV-2抗体检测的内容，进一步指明特异性IgM和IgG阳性、IgG由阴性转为阳性或恢复期较急性期有4倍及以上升高可作为SARS-CoV-2感染的血清学证据[8]。至此，最新第七版诊疗方案正式强调了血清特异性抗体动态检测对COVID-19诊疗的重要性，并提示抗体检测不仅需要定量，还需早期检测以协助疑似病例的诊断；且病例治疗过程中以及康复诊断出院时均需要检测。

冠状病毒至少编码4种结构蛋白，包括棘突蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。目前，国家药监局已审批多个SARS-CoV-2抗体检测试剂盒，主要以N和S蛋白为抗原位点，采用方法有胶体金法和化学发光法。

徐万洲等[9]采用化学发光法试剂对205例COVID-19患者和79例对照者的血清SARS-CoV-2 IgM和IgG进行了检测。病例组包括核酸检测阳性的确诊患者186例、核酸检测阴性但具有COVID-19临床症状和CT影像学特征的患者19例；对照组均为排除SARS-CoV-2感染的其他疾病患者。该研究发现，血清SARS-CoV-2 IgM和IgG的灵敏度分别为70.24%、96.10%，特异度分别为96.20%、92.41%；SARS-CoV-2抗体检测和核酸检测的总符合率为88.03%；在19例核酸检测阴性的确诊患者中，IgM阳性患者为16例(84.21%)，IgG阳性患者为18例(94.74%)。可见，血清SARS-CoV-2 IgM和IgG检测作为COVID-19的诊断指标，可有效弥补核酸检测“漏检”的风险。李萍等[10]也采用化学发光法试剂对116例COVID-19患者和134例对照者的血清SARS-CoV-2 IgM和IgG进行了检测。病例组均具备(新型冠状病毒肺炎)第二版到第六版诊疗方案的病原学证据，对照组包括非SARS-CoV-2感染的住院患者84例和健康体检者50例。该研究发现，血清SARS-CoV-2 IgG的灵敏度90.5%、特异度99.3%均分别显著高于IgM的灵敏度75.9%、特异度94.0%；IgM和IgG联合检测的灵敏度89.7%、特异度100%均分别显著高于IgM的灵敏度、特异度；在COVID-19患者核酸检测转阴后，IgM的阳性率(52.9%vs88.2%)及浓度[13.0(4.9，24.7) AU/mLvs29.5(14.0，61.3) AU/mL]均显著低于核酸检测转阴前；COVID-19患者确诊第1天IgM [19.4(12.4，63.7) AU/mL]和IgG [105.8(74.8，126.1) AU/mL]浓度均显著高于隔3 d后的IgM [15.8(7.1，40.3) AU/mL] 和IgG [80.5(66.7，105.9) AU/mL] 浓度[10]。可见，血清SARS-CoV-2 IgG用于诊断COVID-19具有良好的应用价值；IgM浓度与核酸检测有一定的关联性；IgM和IgG检测联合核酸检测，可能是目前诊断COVID-19的最佳实验室检查方案。

核酸检测虽然对确诊COVID-19具有不可替代的作用，但由于存在不可避免的“假阴性”问题；加之操作步骤较多、耗时较长，对实验室人员技术要求较高，在快速筛查大量疑似患者和密切接触人群时仍有诸多不便。特异性IgM和IgG的检测恰可弥补这一缺陷，实现快速、大规模的批量操作，还可降低医务人员在呼吸道标本采集过程中的暴露风险。

尽管如此，随着SARS-CoV-2 IgM和IgG检测试剂的逐渐推广，实际应用中也出现了较多“假阳性”的反馈，同样困扰临床决策。对此，我们仍有必要对COVID-19血清学检查的临床灵敏度和特异度进行充分验证。首先，考虑到由于病毒进入机体到产生特异性抗体需要一段“窗口期”，抗体检测也可能出现“假阴性”。其次，基于N或S蛋白的抗体血清学检测，可能受其他冠状病毒感染的影响而出现交叉反应，导致“假阳性”结果[11]。再次，抗体检测易受到内源性或外源性干扰物的影响而出现“假阳性”，内源性干扰物一般包括类风湿因子、嗜异性抗体、补体等，外源性干扰物一般包括标本溶血、被细菌污染、贮存时间过长或凝固不全等[12]。因此，在应用SARS-CoV-2抗体检测时，建议结合核酸检测，同时分析IgM和IgG水平，且需要进行多次动态检测，以做出最终诊断意见。

由于SARS-CoV-2抗体检测“假阳性”问题无法完全避免，若单独应用抗体检测对复工、复业等人群进行筛查，必然会出现大量“假阳性”个体，势必造成疫情防控资源的浪费；且即使IgM和IgG检测均为阴性，也不能排除SARS-CoV-2感染[12]。因此，国家药监局特别强调，SARS-CoV-2抗体检测并不适用于一般人群的大规模筛查；现已审批的抗体检测试剂盒仅用于核酸检测阴性疑似病例的补充检测或在疑似病例诊断中与核酸检测协同使用。

4 核酸与抗体联合检测结果的解读

既然核酸检测与特异性抗体检测的联合应用，可有效提高SARS-CoV-2感染的检测效率，那么对于两者联合检测的结果或可正确解读。

一般情况下，IgM在病毒感染早期1周左右出现，是急性期感染的诊断指标；但浓度相对较低、维持时间较短。IgG在病毒感染后3周左右出现，并在体内较长时间存在，抗体滴度有一个持续增高的过程。结合上述规律，我们可通过核酸检测与特异性抗体检测的结果，对SARS-CoV-2感染与否进行判断，见表1。

当核酸检测为阴性时，可通过观察IgM和IgG检测的多次动态变化，从而基本明确的诊断意见。无论后续核酸检测是否为阳性，若1周左右再次检测抗体，IgG由阴性专为阳性，或持续升高达4倍及以上，则可判断急性或近期感染。当然，鉴于免疫方法学检测的特性，需反复强调的是IgM和IgG动态检测的必要性，以尽量减少“假阳性”结果对临床诊疗的误导。

表1 SARS-CoV-2感染的实验室检查结果解读

Table1 Interpretation of laboratory results of SARS-CoV-2 infection

核酸检测特异性抗体检测综合判断RT-PCR检测(+)IgM(-) IgG(-)处于感染后抗体检测“窗口期”IgM(+) IgG(-)处于感染早期或前驱症状期,因IgM多在发病3～5 d后开始出现阳性[8]IgM(-) IgG(+)处于感染中晚期,病毒尚未清除IgM(+) IgG(+)①处于感染症状期或活跃期;②再次复发感染,诊断标准为IgG滴度恢复期较急性期有4倍及以上增高[8]RT-PCR检测(-)IgM(-) IgG(-)无感染者;②流行病学史调查,确认是否为感染潜伏期,排除标准为连续两次核酸检测为阴性(采样时间至少间隔24 h),且发病7 d后的IgM和IgG仍为阴性IgM(+) IgG(-)处于感染急性期(间隔约1周再次检测IgG由阴性专为阳性),核酸检测为“假阴性”,务必复查核酸确认IgM(-) IgG(+)存在既往感染,病毒已清除,处于感染恢复期或已康复IgM(+) IgG(+)①处于感染恢复期,IgM尚未完全消失;②考虑核酸检测为“假阴性”可能,尚需复查核酸确认

5 结 语

综上所述，实验室检查是SARS-CoV-2感染确诊的重要手段，临床实验室可通过将核酸检测作为COVID-19病原学检查“守门人”，协同特异性IgM和IgG检测，以提高检测效率；但仍需进一步结合流行病学史和临床表征综合分析。随着紧急批准上市的SARS-CoV-2感染检测方法与试剂日益增多，有必要尽早实现信息资源共享，进行大规模多中心的临床试验与方法学性能评价，以保证现行检测方案的准确性和有效性，这也是保障目前疫情防控的当务之急。