PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞的表达及其与卵泡液孕激素含量的关系研究

孟金柱，赵成刚，罗碧秀，赵园园

(1.铜仁学院，贵州 铜仁 554300； 2.遥山沟生态种养农民专业合作社，贵州 铜仁 554300)

禽类的卵泡发育是一个连续性过程，且具有优先性。根据卵泡直径的大小及其功能，可以分为等级卵泡和等级前卵泡[1]。等级卵泡，也称为排卵前卵泡，按照大小排列依次为F1、F2、F3、F4、F5…，最大直径能达到40 mm[2]。等级前卵泡则又被分为小白卵泡(SWF,直径为1～2 mm)、大白卵泡(LWF，直径为3～5 mm)、小黄卵泡(SYF，直径为6～8 mm)和大黄卵泡(LYF，直径为9～12 mm)[3]。在这些等级前卵泡中，只有少部分卵泡可以被成功选择进入等级卵泡序列，而直径范围在6～8 mm的SYF又是卵泡在选择过程中能否优先进入等级的转折点[4]。

与哺乳动物相比，禽类卵泡类固醇合成系统较为简单，颗粒细胞的主要功能是分泌孕激素(P4)，而膜细胞则负责分泌雌激素和雄激素[5-6]。这与哺乳动物卵泡颗粒细胞合成雌激素(E2)，膜细胞为颗粒细胞合成雌激素提供前体物质(雄激素)有所不同[7]。颗粒细胞内存在多种受体，在卵泡的生长发育过程中具有重要的作用。若生长、分化出现异常，会导致多囊卵巢综合征、卵巢早衰等疾病[8]。

丝氨酸蛋白酶23(PRSS23)属于丝氨酸蛋白酶(Serine protease)40个家族中的胰蛋白酶家族。通过MCF-7/BUS细胞转染发现，PRSS23mRNA的表达是通过雌激素诱导的[9]。DIAO等[10]研究表明，PRSS23对小鼠卵巢发育有负调控作用，可引起小鼠卵泡闭锁。CHAN等[11]研究发现，PRSS23mRNA在小鼠卵泡的颗粒细胞和排卵前卵巢的间质细胞、膜细胞以及闭锁卵泡中表达量较高，进一步肯定了PRSS23对小鼠卵泡的闭锁起促进作用。

目前，关于PRSS23在大型哺乳动物及禽类卵泡中的功能及作用机制研究尚未见报道。笔者所在课题组前期扩增了蛋鸡卵泡PRSS23mRNA CDS全序列，分析了该序列的三级结构，并进行信号肽预测[12]。为此，通过免疫组织化学技术对PRSS23在蛋鸡卵泡中的表达进行定位，采用荧光定量PCR技术对PRSS23mRNA在其卵泡颗粒细胞中的相对表达情况进行分析，同时通过ELISA技术对卵泡液中的P4进行测定，旨在探明PRSS23在蛋鸡卵泡中的表达位置及其mRNA在不同大小卵泡中的表达与卵泡液P4含量的关系，为进一步研究其在蛋鸡卵泡中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物及样品采集

在遥山沟生态种养农民专业合作社(贵州铜仁)，选取5只健康土母鸡宰杀后，分别获取卵巢并剪下直径为3～5 mm的LWF和直径为6～8 mm的SYF，用于免疫组织化学分析；分别剪下直径为1～2、3～5、6～8、9～12 mm的卵泡，抽取卵泡液用于P4含量测定，剩余部分刮取颗粒细胞用于总RNA提取。

1.2 采用免疫组织化学技术对PRSS23进行组织定位

剪下LWF和SYF，分别放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h后，用70%的乙醇溶液清洗。分别经梯度乙醇(含量递增)脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片(厚度为5 μm)、摊片、烤片后制成切片。将制成的切片放入60 ℃的恒温箱中烘烤3 h，经二甲苯透明、梯度乙醇(含量递减)脱蜡后，滴加3% H2O2灭活内源性过氧化酶，并滴加复合消化酶修复抗原；滴加5% 的牛血清白蛋白(BSA)常温下静置30 min后，试验组滴加兔抗PRSS23一抗(北京华大蛋白质研发中心有限公司，1∶1 000稀释)，对照组滴加正常兔血清(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，4 ℃过夜。经37 ℃恒温箱复温30 min，PBS冲洗，滴加鼠抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，常温孵育30 min，PBS冲洗，DAB(武汉博士德生物工程有限公司)显色5 min，蒸馏水冲洗，苏木精复染60 s，梯度乙醇(含量递增)脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，通过显微镜(Leica公司，德国)采集照片。

1.3 总RNA提取及实时荧光定量PCR分析

将1.1中剪下的SWF、LWF、SYF、LYF，用1 mL注射器抽取卵泡液后，分别在生理盐水中冲洗直至卵黄被清洗干净，使用细胞刮刀刮取位于卵泡内膜上的颗粒细胞用于总RNA提取。

用Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)分别提取5只鸡不同大小卵泡颗粒细胞的总RNA，使用反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)反转录为cDNA，具体反应条件为：42 ℃孵育15 min，85 ℃加热5 s。使用GAPDH作为内参基因，在线NCBI设计引物(表1)，由上海生工生物有限公司合成。

表1 供试引物序列

根据北京全式金产品使用说明书构建20 μL PCR反应体系： 2×TransStart®Tip Green qPCR Super-Mix 10 μL， 上游引物0.4 μL ，下游引物0.4 μL，cDNA 4 μL(100 ng)，RNase-free H2O 5.2 μL。反应程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，45个循环。使用2-△△CT法计算PRSS23基因的相对表达量。

1.4 卵泡液中孕激素含量的测定

使用P4含量ELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)分别对鸡SWF、LWF、SYF、LYF卵泡液中P4含量进行测定，酶标仪读取波长450 nm处的OD值，根据标准品的含量所对应的OD450建立标准曲线，计算样品中的含量。

2 结果与分析

2.1 PRSS23在蛋鸡卵泡内的免疫组织化学分析

通过免疫组织化学技术对PRSS23在蛋鸡卵泡中的表达进行定位，结果表明，PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞层、膜细胞层和卵丘细胞均有表达，且在SYF颗粒细胞层表达量最高(图1)。

A:SYF阴性对照；B:SYF试验组；C:LWF阴性对照； D:LWF试验组；GC:颗粒细胞层；TC:膜细胞层；CC:卵丘细胞A:Negative control of SYF;B:Experiment group of SYF;C:Negative control of LWF;D:Experiment group of LWF;GC:Granulosa cells layer;TC:Theca cells layer;CC:Cumulus cells图1 PRSS23在蛋鸡卵泡中的表达(200×)

2.2 PRSS23基因mRNA在蛋鸡不同大小卵泡颗粒细胞中的表达差异分析

通过实时荧光定量PCR对PRSS23基因在蛋鸡不同大小卵泡颗粒细胞中的表达进行分析，结果(图2)表明，PRSS23基因mRNA在SYF中的含量显著高于其他卵泡(P<0.05)，而在SWF、LWF、LYF颗粒细胞中的含量差异不显著(P>0.05)。

2.3 蛋鸡不同大小卵泡卵泡液中P4含量

通过标准品的含量对应的OD450来建立标准曲线，标准曲线方程为y=3.7x2+10.0x+6.8,R2为0.989 3(图3)。从图4可以看出，P4在SYF卵泡液中的含量显著高于其他卵泡卵泡液(P<0.05)，而在SWF、LWF、LYF卵泡液中的含量差异则不显著(P>0.05)。

不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同

图3 P4含量测定标准曲线

3 结论与讨论

蛋鸡为了维持其产蛋序列等级卵泡中每天有1个卵泡可以排卵，超过99% 的卵泡在发育过程中的不同时期走向闭锁，等级前卵泡被成功选择进入等级卵泡序列，是维持等级卵泡排卵规律的重要标志[13]。在这个过程中，多种激素和细胞因子共同调控旁分泌和自分泌，从而促进颗粒细胞的增殖和分化及子宫内膜细胞和卵母细胞的成熟,最终排卵[14]。直径在6～8 mm的SYF是卵泡在选择过程中优先进入等级还是走向闭锁的转折点[4]。本研究选用LWF和SYF 2种卵泡，发现PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞层、膜细胞层和卵丘细胞均有表达，在SYF颗粒细胞层表达量最高，同时在SYF中的表达量也要高于LWF，这表明PRSS23可能在蛋鸡卵泡发育过程中起了重要的作用。

在动物体内，PRSS是一种通过对蛋白酶原的激活或抑制来参与蛋白质的降解和合成的重要蛋白水解酶类[15]。它主要的生物学功能是通过丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor)调节细胞分化、组织重建、血管形成、胚胎发育和病原侵入等过程[16]，因此，可以看出PRSS是生物体维持正常生命活动过程中重要的蛋白质。WAHLBERG等[17]通过基因芯片技术对处于排卵期的小鼠进行研究发现，PRSS23基因表达量相对较高，且通过促性腺激素下调基因表达。进一步研究PRSS23基因的表达模式发现，PRSS23基因在闭锁卵泡中表达水平最高，而在排卵卵泡中则定位到卵泡膜细胞层和卵巢基质[18]。WAHLBERG等[17]认为，PRSS23可能会抑制卵泡颗粒细胞的增殖，从而导致卵泡闭锁。关于PRSS23在家禽中的研究尚未见报道。本研究表明，PRSS23基因在蛋鸡卵泡颗粒细胞中有表达，且在SYF中表达量显著高于其他等级前卵泡。提示PRSS23在卵泡进入等级还是走向闭锁这个关键节点中发挥着重要作用。

在蛋鸡卵泡液中的激素含量会随着卵泡的发育处于一个动态平衡状态。在8 mm以下的卵泡中颗粒细胞还处于未分化状态，P4的含量较少，到卵泡发育到8 mm左右，已经分化的颗粒细胞开始迅速合成P4，直至排卵[19]。卵泡选择会引起颗粒细胞的分化以及卵泡发育，而在调控卵泡发育的过程中，颗粒细胞中的信号通路又会占主导作用[20]。本研究通过ELISA法对不同大小等级前卵泡卵泡液中的P4进行测定，发现P4在SYF卵泡液中的含量显著高于其他卵泡卵泡液，推测PRSS23在SYF中可能会促进颗粒细胞合成P4，从而影响卵泡的选择。

综上，PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞层、膜细胞层和卵丘细胞均有表达，在SYF颗粒细胞层表达量最高；PRSS23mRNA在SYF中的含量显著高于其他卵泡；P4在SYF卵泡液中的含量显著高于其他卵泡卵泡液。