OC-116基因第1外显子多态性对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的影响

吴 磊，谭光辉，李杰章，覃媛钰，张依裕，田 琴

(1.贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

蛋壳品质是影响家禽生产力的重要性状，直接影响蛋的保存、运输和孵化，其优劣性受到蛋壳形成过程中矿化作用机制的影响[1-2]。壳体在蛋壳腺体(子宫)中形成，约由95%的碳酸钙(方解石形式)组成，蛋壳基质蛋白是禽蛋壳的重要组成部分，约占蛋壳质量的2%[3-4]。蛋壳基质在蛋壳形成中起关键作用，这些基质蛋白由可溶性和不溶性蛋白，糖蛋白和磷酸化蛋白以及蛋白多糖组成[5]。基质蛋白作为禽类蛋壳最主要的有机成分，其合成的速度与数量可能成为影响蛋壳质量的重要因素。目前，已鉴定的蛋壳基质蛋白达1 000余种，OC-116蛋白是鹌鹑和火鸡蛋壳中含量最丰富的蛋壳基质成分之一，OC-116基因可能是影响蛋壳性能的关键控制基因[6-8]。OC-116基因的编码区定位在鸡的4号染色体[9]，开放阅读框(ORF)长为2 411 bp，由5个外显子组成，外显子5序列较长，其他外显子均较短。OC-116蛋白的氨基酸序列中载有2个N糖基化位点和2个二硫化物结合物，在控制蛋壳钙化过程中起主要作用[10-12]。在鸡个体发育早期，一旦成骨开始，OC-116就参与了骨的形成，其功能在进一步矿化过程中得以保持，在成年之后参与蛋壳的形成。此外，OC-116能够显著影响蛋壳表面有机层的沉积，是鸡蛋壳中重要的基质组分[13]。杨凌霄等[14]研究证实,OC-116基因能够调控方解石晶体的生长与形态，从而对蛋壳的形成、质地以及强度有重要影响。为进一步探索OC-116基因第1外显子对蛋壳品质的遗传效应，以产蛋高峰期的长顺绿壳蛋鸡为试验材料，采用直接测序方法筛选其单核苷酸多态性(SNP)位点，获得单倍型与双倍型，并与蛋壳品质进行关联性分析，旨在为长顺绿壳蛋鸡的保种选育和开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)购于天根生化科技有限公司，2×TaqPCR Master Mix 试剂和琼脂糖购自北京康为世纪生物科技有限公司，DM2000 Marker购自重庆擎科生物科技有限公司。

主要仪器：电泳仪(DYY-2C，北京市六一仪器厂)，化学发光荧光全自动分析成像仪(Biosens SC710，上海山富科学仪器有限公司)，梯度PCR仪(PTC200，美国Bio-rad公司)，蛋壳强度测定仪(EFR-01)、蛋品质分析仪(EA-01)均由北京天翔飞域仪器设备有限公司生产，NANODROP 2000 DNA浓度测定仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 试验材料

随机选择饲养于贵州大学动物科学学院实验农场的同日出雏、健康无病、同等管理条件下的45周龄长顺绿壳蛋鸡150只，逐只记录收集产蛋，根据《家禽生产学》[15]中的方法测定蛋质量、蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋壳质量等5个指标。每只鸡翅静脉采血0.2～0.5 mL，参照血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)操作说明书提取基因组DNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳和质量浓度测定联合评估提取质量，稀释成100 ng/μL进行保存备用。

1.3 引物合成及目的片段扩增

根据鸡OC-116基因序列(GenBank登录号：NC_006091.5)，利用Primer Premier 5.0软件设计1对引物，F:5′-AACCTCACAACATTGCACCC-3′，R：5′-GTTACCTGTGCTGCTTGGAG-3′，扩增区域位于基因组g.45667542—g.45667966，为第1外显子区，引物由上海生工生物公司合成。PCR反应体系：1 μL基因组 DNA，上游引物和下游引物各1 μL，10 μL 2×TaqPCR Master Mix，7 μL RNase-free H2O，总体积为20 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性6 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃延伸8 min。反应结束后，135 V电压下1.5%的琼脂糖凝胶电泳20 min，凝胶成像仪检测拍照。

1.4 OC-116基因mRNA二级结构分析

利用在线软件RNAfold (http：//nibiru.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)对OC-116基因编码区序列mRNA二级结构进行预测。

1.5 SNPs筛查和统计分析

应用在线软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/)计算SNPs的基因型频率、等位基因频率、单倍型频率、基因型分布卡方值(χ2)、连锁不平衡的D′值和r2值；采用PopGen32 V1.31软件计算观察杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。参照文献[16-17]的方法，采用SPSS 19.0软件中的一般线性模型分析SNPs基因型、双倍型与蛋壳品质的相关性。分析模型：Y=μ+G+e，Y为性状观测值，G为基因型效应或双倍型效应，μ为群体均值，e为随机残差。采用最小显著性差异法进行多重比较，结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 OC-116基因第1外显子PCR扩增结果

利用设计的引物对长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子进行扩增，结果见图1。结果显示，经过PCR扩增所获得的目的片段呈现单一明亮的条带，且PCR扩增产物与预设片段大小相符，扩增产物可用于切胶回收纯化测序。

2.2 OC-116基因第1外显子SNPs鉴定

通过生物信息学软件DNAStar中的MegAlign和EditSeq程序进行序列比对，结合测序峰图鉴定SNPs，在长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子上共检测到2个新的SNPs。g.45667632 T>C突变产生3种基因型TT、CT和CC，g.45667671 G>A突变产生3种基因型GG、AG和AA(图2)。

图2 OC-116基因第1外显子SNPs序列比对

2.3 OC-116基因第1外显子多态位点遗传多样性分析

由表1可知，长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子g.45667632 T>C位点的CT和T为优势基因型和优势等位基因，g.45667671 G>A位点的AG和G分别为优势基因型和优势等位基因，频率均为0.54和0.61。2个SNPs多态信息含量(PIC)均为中度多态，杂合度(He)均较高。通过卡方(χ2)检验发现，2个SNPs基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.4 OC-116基因第1外显子连锁不平衡、单倍型和双倍型分析

对长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子2个SNPs g.45667632 T>C和g.45667671 G>A进行连锁不平衡分析，D′和r2值均为1，2个SNPs完全连锁。对长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子2个SNPs进行单倍型和双倍型分析，结果见表2。由表2可知，在检测的长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子中g.45667632 T>C和g.45667671 G>A位点存在2种单倍型H1和H2，频率分别为0.61和0.39。共检测到3种双倍型，双倍型H1H2频率最高，为0.54；其次是双倍型H1H1，频率为0.34；双倍型H2H2频率最低，为0.12。

表1 OC-116基因第1外显子多态位点的遗传特性

表2 OC-116基因第1外显子2个SNPs的单倍型和双倍型Tab.2 Haplotypes and diplotypes of the two SNPs in exon 1 of OC-116 gene

2.5 OC-116基因第1外显子mRNA序列二级结构分析

对长顺绿壳蛋鸡OC-116基因的mRNA序列进行二级结构分析，结果见图3。CA组合的mRNA序列结构的自由能为-1 351.40 kcal/mol，TG组合的自由能为-1 350.10 kcal/mol，突变引起自由能升高，稳定性降低。

2.6 OC-116基因第1外显子SNPs与长顺绿蛋鸡蛋壳品质的关联性分析

图3 OC-116基因mRNA序列的二级结构

对OC-116基因第1外显子2个SNPs g.45667632 T>C和g.45667671 G>A与长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质进行关联性分析，结果见表3。由表3可知，基因型CC和AA在蛋质量上显著高于基因型TT和GG(P<0.05)，双倍型H2H2在蛋质量上显著高于双倍型H1H1(P<0.05)；基因型TT和GG在蛋形指数上显著高于基因型CT和AG(P<0.05)，双倍型H1H1在蛋形指数上显著高于双倍型H1H2(P<0.05)；基因型CT和AG在蛋壳强度上显著高于基因型TT和GG(P<0.05)，双倍型H1H2在蛋壳强度上显著高于双倍型H1H1(P<0.05)。各基因型和双倍型的蛋壳厚度、蛋壳质量均无明显差异。

表3 OC-116基因第1外显子SNPs与长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的关联性分析

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

3 结论与讨论

虽然鸡蛋壳仅占蛋总质量的约10%，但它具有为蛋提供微生物和物理保护的重要功能，在确保食品安全和更好的孵化率方面发挥着关键作用。蛋壳损坏是一个严重的问题，是养禽业的重大经济损失，据估计，因蛋壳质量问题损失的鸡蛋占产蛋总量的8%～11%[17]。OC-116蛋白首先在蛋壳中鉴定到，是鸡蛋壳基质的主要成分，参与蛋壳钙化，对蛋壳品质有重要的影响[18]。AHMED等[19]证明，老龄母鸡强制换羽后蛋壳强度显著变好，而蛋壳基质中的OC-116含量也显著增加，发现OC-116与蛋壳表面有机层的沉积密切相关。本研究对长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子区进行SNPs检测，共筛选到2个为中度多态且完全连锁的SNPs，为g.45667632 T>C和g.45667671 G>A，2个SNPs均产生3种基因型。基因在配子中的随机分离和在合子里的随机重组都会导致一定的误差，引起基因频率的变化，即随机漂变引起基因频率偏离Hardy-Weinberg平衡[20]。本研究发现的2个SNPs均未偏离Hardy-Weinberg平衡，说明未受到突变、选择、遗传漂变等的影响，或者是受到影响而由于长期的人工选择并进行大规模扩群后又重新处于一种新的平衡状态。2个突变位点联合产生2种单倍型和3种双倍型，理论上应该有4种单倍型(缺少H3/CG和H4/TA)和10种双倍型，实际观察值与理论值存在差异，可能是由于长期人工选育导致或者根本不存在H3和H4单倍型。生物信息学分析发现，基因变异使mRNA二级结构自由能升高，稳定性降低，且有可能对蛋白质的翻译造成影响[21]。

OC-116在骨骼和蛋壳矿化中发挥作用，为蛋壳基质的主要蛋白质之一，决定了蛋壳强度、蛋壳厚度，最终确定了蛋的形状[2]。作为蛋壳基质蛋白之一，OC-116已被鉴定是鸡蛋壳蛋白质组中最丰富的蛋白质[22-24]。HINCKE等[25]和SOCHA等[26]均报道，OC-116作为最丰富的蛋壳基质蛋白，与蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳强度有关。张璐[27]报道，OC-116基因多态性对蛋壳厚度和蛋壳强度有极显著影响。蛋形指数衡量蛋的形状是否正常，正常蛋形指数是1.30～1.35，高于或低于此值则为不正常，影响种蛋孵化率；蛋壳厚度、蛋壳质量受品种、气候、饲料、生产日龄以及产蛋鸡内分泌功能的影响，蛋壳强度是蛋壳耐压程度的大小。本研究对长顺绿壳蛋鸡OC-116基因第1外显子SNPs与蛋壳品质进行关联性分析发现，基因型CC、AA和双倍型H2H2在蛋质量上显著高于基因型TT、GG和双倍型H1H1(P<0.05)，基因型TT、GG和双倍型H1H1在蛋形指数上显著高于基因型CT、AG和双倍型H1H2(P<0.05)，基因型CT、AG和双倍型H1H2在蛋壳强度上显著高于基因型TT、GG和双倍型H1H1(P<0.05)。综合考虑，基因型CC、AA是改善蛋壳品质的有利基因型，双倍型H2H2是改善蛋壳品质的有利双倍型。