乳腺癌变过程VDR和Snail表达的临床意义和预后关系

穆亚男，杜小明，熊世双，张德瑞，蒋金芳，李 军，曹玉文 (.石河子大学医学院病理系，石河子大学医学院第一附属医院病理科，新疆 石河子 8000；.皖北煤电集团总医院肿瘤一科，安徽 宿州 4000；.石河子大学医学院第一附属医院超声科，新疆 石河子 8000)

乳腺癌变进展通常是从普通型导管增生(usual ductal hyperplasia，UDH)、导管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)到浸润性导管癌(infiltrating ductal carcinoma，IDC)的过程。笔者前期研究及文献发现，锌指转录因子Snail与乳腺癌发生有着密切关系。Snail下游存在众多的调控因子，其中VDR(Vitamin D receptor，维生素D受体)是一个重要的Snail下游调控因子。结直肠癌中Snail特异性结合VDR启动子区域E-box序列，抑制VDR转录和表达[1-2]。骨软骨瘤细胞中沉默Snail表达，提高了VDR表达，增强VD3抗增殖和促凋亡能力[3-4]。乳腺癌细胞中，VDR过表达导致Snail下调[5-6]。因此，笔者在乳腺癌变过程组织中，检测Snail和VDR蛋白差异性表达，分析与临床病理指标的关系及在预后中的价值，为乳腺癌诊断治疗提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1材料：收集我院病理科2005年6月～2015年8月间石蜡包埋乳腺组织共591例，均为女性，年龄31～80岁，其中IDC 318例， DCIS 61例，UDH 73例，ANBT(距乳腺癌组织至少5 cm以上)139例。所有患者均无术前治疗，所有病理切片均由多名诊断医生复诊。同时收集乳腺癌患者临床病理参数，包括年纪、组织学分级、淋巴结转移情况、原发肿瘤、淋巴结及远行转移分期和ER、PR、HER-2表达情况等。所有患者均已签署知情同意书，且本研究已获得我院伦理委员会审批。

1.2方法

1.2.1免疫组化EnVision法检测VDR和Snail在乳腺癌变过程组织中蛋白表达。石蜡包埋的乳腺组织，连续切片后烘烤，依次过二甲苯脱蜡、酒精水化，高压抗原修复后双氧水封闭，PBS冲洗，分别加一抗(VDR抗体，Santa Cruze，1∶200； Snail抗体，Abcam，1∶50)4℃孵育过夜，二抗(山羊抗兔/鼠)室温孵育，DAB显色，苏木素复染，分化脱水后树胶封片。染色结果由两位病理医师采用双盲法判读。VDR蛋白定位在乳腺上皮细胞膜或浆，阳性细胞的百分比﹤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。着色强度无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。评定结果阳性细胞×着色强度分为0～12分，其中0～4分为低表达，5～12分为高表达。Snail蛋白定位于细胞核，阳性细胞百分比≤10%为低表达，大于10%为高表达。

1.2.2GEPIA(Gene Expression Profilling Interactive Analysis，http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库能够根据不同癌症类型或病理分期分析基因在肿瘤/正常中差异表达、患者生存分析、基因相关性分析和降维分析[7]。笔者使用 GEPIA 来验证 VDR与Snail表达相关性；P<0.05为差异具有统计学意义。

1.2.3Bc-GenExMiner(Breast Cancer Gene-Expression Miner version 4.1, http:// bcgenex.centregauducheau.fr)工具用于分析基因组数据集表达、预后和相关性[8]。笔者评估了VDR，Snail分别与乳腺癌患者ER、PR、Her2、SBR分级等临床病理参数间的相关性；P<0.05被认为差异具有统计学意义。

1.2.4Kaplan-Meier plotter(http:// kmplot.com/analysis/)能够评估基因表达对不同肿瘤类型存活率的影响[9]。它用于检测VDR和Snail mRNA转录水平的预后价值。设置条件如下：cancer: Breast cancer; gene : VDR/Snail; survival : Overall survival (OS)。对数秩检验用于分析Kaplan-Meier生存曲线。计算出具有95%置信区间(CI)的危险比(HR)；P<0.05被认为指示统计学上的显著差异。

1.3统计学分析：采用SPSS22.0软件进行统计学分析。两组间表达差异比较采用t检验。相关性采用Spearman相关性分析法和χ2检验或Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1乳腺癌变组织VDR和Snail蛋白差异性表达:VDR蛋白定位于上皮细胞膜和浆，Snail蛋白表达于细胞核。 VDR从ANBT、UDH、DCIS和IDC组中着色强度由棕褐逐渐变为浅黄色，其表达逐渐下降；Snail着色强度由浅黄逐渐变为棕褐色，其表达逐渐升高。

VDR在四组乳腺组织间表达两两比较有显著差异，除外UDH与DCIS、DCIS与IDC两组。Snail在ANBT与IDC组中的表达有统计学意义，见图1。

2.2乳腺癌变组织VDR和Snail表达相关性:VDR和Snail蛋白在各组乳腺组织中表达的相关性分析，结果发现VDR和Snail蛋白在IDC组织中呈显著负相关趋势，见表1。GEPIA数据库显示VDR和Snail mRNA表达明显负相关性，这与笔者的实验结果一致，见图2。

2.3乳腺癌VDR和Snail表达与临床病理参数的关系:结果显示VDR在淋巴结转移阴性、Her-2阴性患者中的表达显著高于淋巴结转移阳性、HER-2阳性者，VDR分子在ER阴性、SBR分级Ⅰ～Ⅱ患者中表达高于ER阳性及SBR分级Ⅲ级者，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。Bc-GenExMiner数据库分析发现，VDR在ER阴性、SBR分级Ⅰ～Ⅱ级中表达明显高于ER阳性及SBR分级Ⅲ级患者，与笔者实验结果一致，见图3。

乳腺组织中VDR和Snail蛋白表达，*P<0.05。 a. VDR组间表达比较；b. Snail组间表达比较

表1 VDR与Snail蛋白表达在IDC组织中的相关性

指标VDR-++++++r值P值Snail-0.4080.001-652324+862527++101588+++202121

图2 VDR与Snail mRNA表达相关性

表2 VDR蛋白与临床病理参数间的相关性

项目总例数VDR low(-/+)例数%χ2值P值Age<50942728.71.280.257≥501866635.5SBR分级Ⅰ～Ⅱ级1103733.60.020.904Ⅲ级1705632.9淋巴结转移-1262822.212.470.001①+1546542.2TNM分期Ⅰ～Ⅱ期1726437.23.210.073Ⅲ～Ⅳ期1082926.8ER-1354029.61.510.219+1455336.5PR-1384633.30.0020.967+1424733.1Her2-2056129.74.120.043①+753242.7

注：①P<0.05

a. VDR mRNA表达与ER的关系；b. VDR mRNA表达与SBR分级的关系

Snail蛋白在乳腺癌无淋巴结转移、TNM Ⅰ～Ⅱ期中表达显著低于淋巴结转移阳性与Ⅲ～Ⅳ期患者，Snail分子在 Her2阴性、SBR分级Ⅰ～Ⅱ患者表达低于HER-2阳性及SBR分级Ⅲ级者，而在ER阴性患者表达高于ER阳性者，均无统计学差异，见表3。数据库分析与笔者的结果相同，Snail在HER-2阴性、SBR分级Ⅰ～Ⅱ级患者中表达明显低于HER-2阳性及SBR分级Ⅲ级患者，在ER阴性表达明显高于ER阳性患者，见图4。

2.4VDR和Snail表达与乳腺癌患者预后的关系:使用线上Kaplan-Meier plotter生存分析工具，对VDR和Snail表达与乳腺癌患者预后的关系进行探索，结果显示，VDR低表达的乳腺癌总体生存时间(OS)明显小于VDR高表达患者，见图5a。而Snail高表达患者总体生存时间也显著小于Snail低表达者，见图5b。

表3 Snail蛋白与临床病理参数间的相关性

项目TotalSnail high(++/+++)例数%χ2值P值Age<501187866.12.050.152≥50824656.1SBR分级Ⅰ～Ⅱ级1368058.81.820.177Ⅲ级644468.7LN metastasis-1116054.16.690.010*+896471.9TNM分期Ⅰ～Ⅱ期17110058.56.200.013*Ⅲ～Ⅳ期292482.8ER-1066662.30.0070.935+945861.7PR-1056965.71.290.255+955557.9Her2-543259.30.240.627+1469263.0

a. Snail mRNA表达与ER关系；b. Snail mRNA表达与Her关系；c. Snail mRNA表达与SBR分级关系

a. VDR mRNA表达与OS之间关系；b. Snail mRNA水平与OS之间关系

3 讨论

研究发现，VDR蛋白在乳腺癌变进展过程即ANBT→UDH→DCIS→IDC中的阳性率逐渐降低，提示VDR在乳腺癌变过程中可能充当着抑癌基因角色。文献显示，VDR在乳腺组织中表达呈多样化，早期研究[10-11]表明VDR在乳腺癌组织中高表达，随后学者发现[12-13]并验证VD类似物对乳腺癌的治疗作用，之后越来越多研究[14-16]显示VDR蛋白和mRNA在乳腺上皮细胞高表达可以降低癌变几率,与笔者的实验结果相符。本实验分析了VDR在四组乳腺组织中的表达，VDR在ANBT中表达分别显著高于UDH、DCIS和IDC，并且ANBT明显高于IDC，虽然DCIS中表达高于IDC组，但是统计学上无显著差异，提示VDR蛋白低表达可能促使正常乳腺上皮发生良性增生甚至癌变，在癌症的早期阶段起到抑癌作用，与乳腺癌晚期浸润的相关性不显著。VDR蛋白在淋巴结转移阴性和HER-2阴性乳腺癌中表达明显升高，Bc-GenExMiner数据库显示VDR在ER阴性、SBR分级Ⅰ～Ⅱ级中表达显著升高，提示VDR蛋白可能承担着减缓乳腺癌淋巴结转移和预示更好乳腺癌分子分型的角色。VDR低表达的乳腺癌患者总体生存时间明显小于VDR高表达者，这与Lopes的研究[17]结果相呼应，说明VDR是乳腺癌预后的一个保护性因素。

结果显示，Snail蛋白在乳腺癌变过程组织中逐渐升高，提示Snail在乳腺癌发生中充当一个癌基因的角色，与Leong KG研究[18]结果趋势相近。进一步比较Snail在四组乳腺组织中表达，发现Snail在IDC组表达显著高于ANBT，从ANBT到UDH、DCIS发展到IDC时，Snail表达差异不显著，说明Snail可能促进了正常乳腺到浸润性乳腺癌的发生。同时，笔者发现Snail蛋白在淋巴结转移阳性、TNM分期晚期的患者中表达明显升高，数据库显示Snail在HER-2阴性、SBR分级Ⅰ～Ⅱ级患者中表达明显降低，在ER阴性者表达明显升高，并且Snail高表达的患者总体生存时间更短，说明Snail蛋白表达与乳腺癌分子分型相关，在乳腺癌发生淋巴结转移和晚期进展中发挥促进作用，并预示着患者有更差的预后。Saad等人发现Snail蛋白表达上调，能够启动EMT，促进了乳腺癌发生以及增加乳腺癌进展的几率[19]。因此，Snail作为一个促癌基因可能不仅导致乳腺癌变而且能促进乳腺癌浸润转移进而标志更差的预后。

笔者分析VDR和Snail蛋白在乳腺癌变过程组织中表达的相关性，二者在IDC组中表达呈显著负相关，在ANBT和DCIS组也呈负相关性，差异不明显，提示Snail和VDR分子在乳腺癌变和进展过程中起着负性相关的协同促进作用。Shehla Pervin等研究[5]VDR mRNA在乳腺癌细胞中过表达导致Snail下调从而损害细胞成球能力，并且Larriba MJ等发现VDR在结直肠癌中表达是缺失的，Snail作为EMT发起的诱导物，抑制VDR基因启动子区[2]。因此，笔者推测Snail可能作为乳腺组织中VDR的上游调控因子，通过抑制VDR表达促进乳腺癌的发生、发展。