Ube2s 在小鼠卵泡发育和黄体形成过程中的表达研究

吴 浩，于浩楠，倪 华

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

卵巢是雌性哺乳动物重要的生殖器官之一，其主要功能是产生卵子和分泌类固醇激素[1]。蛋白泛素化修饰属于翻译后修饰，受到该修饰的蛋白质参与细胞周期调控[2]、DNA 修复[3-4]、细胞凋亡[5]和癌症发生[6-10]等一系列生理过程。有研究表明，泛素化参与卵巢生理过程，例如泛素连接酶CRL4 复合体可以维持卵母细胞的存活，在雌性生殖力维持中发挥至关重要的作用[11]。

蛋白泛素化由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3 3 种酶共同完成[12]，其中E2 能够控制泛素链的开始和延长转换，调节链形成和持续合成能力，从而决定泛素链的长度和连接类型，对泛素链的组装起重要的调控作用[13-14]。泛素结合酶E2 S（Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 S，Ube2s）是E2 家族成员。有研究表明，Ube2s介导K11 连接的多聚泛素链，参与DNA 损伤修复[4]；Ube2s延长Ube2c 介导的泛素链，降解周期蛋白B1 促进有丝分裂[15]，但Ube2s在卵巢中的表达及功能研究没有报道。本研究以小鼠为动物模型，利用原位杂交、免疫组织化学和实时荧光定量PCR 技术，结合不同日龄小鼠卵巢发育模型、孕马血清促性腺激素（PMSG）诱导卵泡发育模型、人绒毛膜促性腺激素（hCG）诱导的排卵模型和黄体形成与退化模型，研究Ube2s在小鼠卵巢组织中的表达变化，为阐明泛素化在卵巢生理过程中的调控机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 中国昆明白色近交品系小鼠。人工控制条件下饲养，室温23～25℃，光照周期为12 h 光照，12 h 黑暗，自由取食及饮水。

1.2 实验动物模型

1.2.1 性成熟模型 分别选取1、5、10、15、20、25、30 日龄雌性小鼠，采集卵巢，每个日龄组6 只小鼠。

1.2.2 PMSG 诱导卵泡发育模型 选取21 日龄雌鼠，腹腔注射PMSG（5 IU/只），在注射PMSG 后的0、0.5、1、3、6、12、24、36、48 h 采集卵巢，并以21 日龄小鼠卵巢为对照，每组6 只小鼠。

1.2.3 hCG 诱导的排卵模型 选取21 日龄雌鼠，腹腔注射PMSG（5 IU/只）48 h 后注射hCG（5 IU/只），在注射hCG 后第0.5、1、3、5、7、9、11 小时采集卵巢，每组6 只小鼠。

1.2.4 hCG 诱导的黄体形成与退化模型 选取21 日龄雌鼠，腹腔注射PMSG（5 IU/只）48 h 后注射hCG（5 IU/只），在注射hCG 后第1、2、3、4、5、7、9、11、13、15天采集卵巢，每组6 只小鼠。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠Ube2s基因片段克隆及探针的制备 根据GenBank 中小鼠Ube2s基因序列，设计上、下游引物（上游引物：5'-AATGTGCTCAAGAGGGACTG-3'，下游引物：5'-AGCTTCTTATCTCGCTCACC-3'）；以小鼠卵巢cDNA 为模板进行PCR 扩增，纯化产物后与pGEM-T载体连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取单菌落摇菌，将菌液送交北京擎科生物科技有限公司进行测序；将测序结果BLAST 同源性比对，确认Ube2s基因片段克隆正确后，利用DIG RNA labeling kit 试剂盒（Roche，11175025910 1 kit）进行探针标记。

1.3.2 原位杂交 将冰冻切片（10 μm）于4% 多聚甲醛（Sigma，P6148）中固定1 h，1% TritonX-100 溶液处理切片20 min，室温下滴加预杂交液（5×柠檬酸钠缓冲液（SSC），50% 甲酰胺）预杂交15 min；弃去预杂交液，后滴加杂交液（5×SSC，50% 甲酰胺，0.02% BSA，10% 硫酸葡聚糖，1 mg/mL 变性的地高辛标记的Ube2sRN 探针）于55℃杂交16 h；将切片分别在含有5×SSC、2×SSC、0.2×SSC 的溶液中55℃摇床分别洗涤30 min；经缓冲液Ⅰ（100 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）平衡5 min 后，在1%Blocking solution 中封闭1 h。封闭后加碱性磷酸标记的地高辛抗体（1:5000，Roche）4℃孵育过夜；切片洗涤后，再滴加显色液（0.4 mmol/L 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，0.4 mmol/L 硝基四唑氮蓝和2 mmol/L 左旋咪唑），避光显色，出现阳性信号后，停止显色；1%甲基绿复染，显微镜下观察并拍照。

1.3.3 免疫组织化学 取小鼠卵巢组织经10%中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋后，制成5 μm 切片；二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、0.01% 柠檬酸缓冲液修复、3%H2O2封闭内源性过氧化物酶、10% 马血清封闭后，加入Ube2s兔源抗体（Abcam，ab197945，1:200）4℃过夜；用Goat Anti-rabbit IgG/HRP（Abcam，ab6721，1:200）37℃孵育90 min；DAB 显色剂显色，苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检并拍照。

1.3.4 实时荧光定量PCR 提取小鼠卵巢组织（30～40 mg）总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA 为模板进行扩增；Ube2s（Ube2s序列号：NM-133777.2）引物序列：上游引物5'-AATGTGCTCAAGAGGGACTG-3'，下游引物5'-AGCTTCTTATCTCGCTCACC-3'，由北京擎科生物科技有限公司合成；10 μL 反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ0.2 μL，上、下游引物（10 mol/L）各0.2 μL；反应条件：95℃预变性30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40 个循环；使用 Amplied Biosystems®7500 Real-Time PCR System 操作，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.4 统计分析 采用 GraphPad Prism 5.0 软件绘图并分析数据，实验数据用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或 Student's t 检验，检验水准（α）为0.05。

2 结果与分析

2.1Ube2s在性成熟小鼠卵巢中的表达 小鼠卵巢发育过程中，5 日龄小鼠卵巢中可以看到原始卵泡；10 日龄小鼠卵巢中出现初级卵泡；10、15 日龄小鼠卵巢中可以看到初级卵泡；25 日龄小鼠卵巢中出现次级卵泡；30 日龄的小鼠卵巢中各级卵泡都存在。

原位杂交结果显示，Ube2smRNA 在原始卵泡的颗粒细胞中有表达（图1-A）；随着卵泡的发育，Ube2smRNA 在初级卵泡（图1-B～C）和次级卵泡（图1-D）的颗粒细胞中高表达；在有腔卵泡的颗粒细胞中的表达量明显降低（图1-E）。Ube2smRNA 在原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中高表达；随着卵泡发育Ube2smRNA 在卵母细胞中的表达量水平逐渐降低（图1-D～E）。免疫组织化学结果表明Ube2s蛋白表达与mRNA 表达一致（图1-G～I）。

实时荧光定量PCR 结果显示（图1-F），Ube2smRNA 在5、15、30 日龄的小鼠卵巢组织中表达水平逐渐下降（P＜0.05）。

2.2Ube2s在PMSG 诱导的小鼠卵泡发育过程中的表达注射PMSG 1 h 后小鼠卵巢中大量卵泡开始发育，注射PMSG 1、3、6 h 后小鼠卵巢中的卵泡可以看到次级卵泡；在注射PMSG 12 h 后，小鼠卵巢中出现有腔卵泡；注射PMSG 24、48 h 后小鼠卵巢中有腔卵泡的空腔逐渐变大。

原位杂交结果显示，Ube2smRNA 在注射PMSG 1、3、6 h 后小鼠卵巢中次级卵泡的颗粒细胞中高表达，在次级卵泡的卵母细胞中低表达（图2-A～C）；随着注射PMSG 的时间延长，Ube2smRNA 在注射PMSG 12、24、48 h 后的小鼠卵巢中有腔卵泡的颗粒细胞和卵母细胞的表达逐渐减弱（图2-D～F）。免疫组织化学结果表明，Ube2s蛋白表达与mRNA 表达一致（图2-H～L）。

实时荧光定量PCR 结果显示（图2-G），Ube2smRNA 在注射PMSG 1、6、12、24、48 h 后的小鼠卵巢组织中表达水平逐渐下降（P＜0.05）。

2.3Ube2s在PMSG/hCG 诱导的小鼠成熟卵泡排卵过程中的表达 给21 日龄雌性小鼠注射PMSG/hCG 诱导排卵。注射hCG 0.5、5 h 后小鼠卵巢中卵泡出现三级卵泡，注射hCG 7、9、11 h 后，小鼠卵巢中卵泡出现成熟卵泡。

原位杂交结果显示，注射hCG 0.5、5 h 后，Ube2smRNA 在三级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中表达弱（图3-A～B），注射hCG 7、9、11 h 后，Ube2smRNA 在成熟卵泡的卵母细胞中表达很弱（图3-C～E）。免疫组织化学发现，Ube2s蛋白表达与mRNA 表达一致（图3-G～J）。

实时荧光定量PCR 结果显示（图3-F），Ube2smRNA 在注射hCG 1、7、11 h 后的小鼠卵巢组织中表达水平逐渐减弱（P＜0.05）。

2.4Ube2s在黄体形成与退化过程中的表达 原位杂交结果显示，注射hCG 12 h 后，成熟卵泡排卵，颗粒细胞黄体化。注射hCG 第1 天和第3 天后Ube2smRNA在新生黄体中强表达（图4-A～B）；注射hCG 第4～11天后，Ube2s在黄体中的表达逐渐减弱（图4-C～E），在注射hCG 第11 天黄体基本已经退化，在退化的黄体中Ube2smRNA 表达水平变低。

免疫组织化学结果显示，注射hCG 第1 天后在新生黄体中Ube2s蛋白表达强（图4-G），注射hCG 第3～11 天后Ube2s在黄体中的表达逐渐减弱（图4-H～J）。

实时荧光定量PCR 结果显示（图4-F），Ube2smRNA 在注射hCG 第1、7、11 天后小鼠卵巢组织中表达水平逐渐下降（P＜0.05）。

图1 Ube2s 在性成熟前后小鼠卵巢中的表达

3 讨 论

哺乳动物的卵巢周期性进行卵泡发育和黄体的形成与退化，卵泡发育主要包括卵泡中颗粒细胞增殖与分化和卵母细胞生长与成熟[16]；排卵后由残存的颗粒细胞和内膜细胞分化形成黄体，在未受精时黄体的正常退化又是下一轮生殖周期启动所必需的[17]。

本研究结果表明，在不同日龄的正常发育小鼠卵巢中，Ube2s在原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中高表达，在次级卵泡和有腔卵泡的卵母细胞中表达降低。在PMSG 诱导的卵泡发育模型中，Ube2s的表达规律与在正常发育小鼠卵巢中的表达规律一致。Ben-Eliezer 等[18]在体外分离小鼠卵母细胞，发现Ube2s在小鼠卵母细胞中表达，并延长后期促进复合物APC/C（一种E3 连接酶）形成的泛素链作用于细胞周期蛋白B 促进卵母细胞染色体分离，完成第一次减数分裂。本研究中Ube2s在卵泡的卵母细胞发育过程中呈现规律性表达，并且在卵泡的卵母细胞发育的早期高表达。本研究结果与Ben-Eliezer 等[18]研究结果一致，提示Ube2s在小鼠卵泡的卵母细胞发育的早期参与更复杂的调控机制。

图2 Ube2s 在小鼠卵泡发育过程中的表达

图3 Ube2s 在小鼠成熟卵泡排卵过程中的表达

图4 Ube2s 在黄体形成与退化过程中的表达

本研究结果表明，在正常发育小鼠卵巢中，Ube2s在原始卵泡的颗粒细胞检测到表达；在初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞呈强表达；在有腔卵泡的颗粒细胞表达较低。PMSG 诱导的小鼠卵泡发育模型结果显示Ube2s的表达规律与其表达规律一致。小鼠卵巢原始卵泡的颗粒细胞处于单层扁平状，初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞处于快速增殖时期，Ube2s在此时呈强表达，提示Ube2s可能与颗粒细胞的增殖有关。有研究表明，Ube2s促进多种细胞增殖，如在人乳腺癌细胞中，APC/C与Ube2c 催化形成泛素链，Ube2s可以延长其泛素链，从而降解细胞周期蛋白B1 促进人乳腺癌细胞有丝分裂[15]；在人肝癌细胞（HCC）中Ube2s高表达，促使p53 泛素化并降解从而促进HCC 增殖[9]；在小鼠ES 细胞中Ube2s介导多聚泛素链形成，通过蛋白酶体介导Sox2 的降解从而增强ES 细胞的自我更新和多能状态[19]。综上推测，Ube2s通过泛素化修饰可能降解某种蛋白参与卵巢颗粒细胞的增殖，为后续研究Ube2s在卵巢颗粒细胞中的作用机制打下基础。

排卵后，由壁层颗粒细胞、内膜细胞、外膜细胞和侵入的血管组织分化形成黄体[20]。本研究结果表明，Ube2s在注射hCG 后的第1～4 天黄体形成期的黄体细胞中强表达；在注射hCG 后的第7～15 天黄体退化期的黄体细胞中低表达。黄体形成期，黄体体积变大，黄体细胞增殖；退化时期黄体分泌孕酮下降，黄体组织被破坏，黄体体积变小。本实验发现Ube2s在黄体细胞增殖时期高表达，并且有研究表明Ube2s促进多种细胞增殖[7-11]，提示Ube2s可能参与黄体细胞的增殖以及参与形成具有分泌孕酮功能的黄体。综上推测，Ube2s可能与黄体的形成与退化有关。

4 结 论

本研究发现，Ube2s在小鼠卵泡发育和黄体形成与退化过程中呈规律性表达：Ube2s在小鼠原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中呈强表达，在次级卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡的卵母细胞中表达逐渐减弱；Ube2s在原始卵泡的颗粒细胞中有表达，在初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞中呈强表达，在有腔卵泡的颗粒细胞中Ube2s表达变弱，提示Ube2s与卵泡发育有关。Ube2s在新生黄体中表达强，Ube2s在退化的黄体中表达逐渐降低，提示Ube2s与黄体的形成与退化有关。泛素化机制在卵巢功能的研究中刚刚起步，关于Ube2s在小鼠卵泡发育和黄体形成过程中表达的研究，可以作为研究卵巢发育过程中蛋白泛素化调控的切入点，为研究泛素化作用机制和卵巢生理机制研究提供实验依据。