广西麻鸡产蛋相关基因的SNPs 检测及其与蛋用性能关联分析

李凤宁，徐桂云，张俊楠，王喜琼，李 毅，韦凤英

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.广西畜牧研究所，广西南宁 530001；3.广西鸿光农牧有限公司，广西玉林，537500）

随着生活水平的不断提高，人们对于食品品质的要求也越来越高。在此背景之下，鸡蛋仅定位于营养层面已无法满足消费者对其风味和蛋品质量的追求。在市场导向作用下，我国蛋品产业产品结构得到不断优化并逐渐呈现多样性，品种结构由单一向多元化转变，优质蛋的消费比例也在逐渐增加。

我国鸡品种资源丰富，但是地方品种基本用于生产鸡肉，在产蛋性能方面多数未经过严格选育，产蛋率不高。根据消费者对优质鸡蛋的需求以及养殖者对蛋鸡生产性能的要求，优质蛋鸡产蛋性能的选育逐渐被重视。本研究拟选择9 个与产蛋量、就巢性、开产日龄等性状相关的候选基因，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的手段检测上述基因的SNP位点在群体中的分布情况，并分析其与生产性能的关联性，以确定可能影响产蛋性能的SNPs，为提高地方品种鸡产蛋性能的分子标记育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本研究以广西畜牧研究所和广西鸿光农牧有限公司共同培育的广西麻鸡为实验材料，根据产蛋记录将鸡群分为高产组和低产组（高产组母鸡开产至300 日龄总产蛋数与低产组差异在20 个以上），并从2组鸡中挑选400 只母鸡（高低产各200 只），统计每只鸡的开产体重（FEBW）、开产日龄（FED）、300 日龄产蛋数（300DEM）、300 日龄体重（300DBW）和瑕疵蛋个数（REM）。

在实验鸡群300 日龄时连续3 d 采集鸡蛋，每个个体至少收集1 个鸡蛋（剔除破蛋、软壳蛋和双黄蛋），共收集到337 个个体共358 个鸡蛋，测定内部和外部蛋品质性状。

1.2 实验方法

1.2.1 SNPs 位点的挑选 以查阅文献的方式在9 个候选基因上挑选出在各个地方品种上报道的与产蛋量、就巢性、开产日龄3 个性状显著相关的SNPs 位点共18 个（表1）。

1.2.2 血样采集及DNA 提取 对高低产实验组共400只母鸡进行翅下静脉采血，注入装有2%EDTA 抗凝剂的离心管中，-20℃保存。使用血液基因组DNA 提取试剂盒（DP318）（Tiangen，天根）提取基因组DNA。

1.2.3 MALDI-TOF MS SNPs 位点分型 采用Sequenom公司的MassArrrayTMiPLEX 飞行时间质谱基因分型平台对本实验的多态位点进行基因分型。根据SNP 位点上下游的序列信息，使用Sequenom 公司的引物设计软件Assay design 3.1 进行单碱基扩增引物的设计，并提交给生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成，引物序列如表2 所示。

表1 SNP 位点信息

1.2.4 数据统计与分析 对FEBW、FED、300DBW、REM、蛋重（AW）、蛋形指数（ESI）、蛋壳强度（ESS）、蛋白高度（AH）、蛋黄颜色（YC）、蛋壳厚度（EST）、蛋黄比例（YR）和蛋壳比例（ESR）等性状值进行排序，分别按照各个指标选取数据两尾100 只个体数据，建立两尾实验群体。运用 Haploview 4.1 软件的Case-Control 模块进行关联分析。

2 结果与分析

2.1 SNPs 检测和多态性分析结果 运用MALDI-TOF MS对18 个多态位点进行基因分型检测，分型结果如图1 所示。其中，共有12 个位点SNP_1、SNP_2、SNP_3、SNP_4、SNP_5、SNP_7、SNP_8、SNP_9、SNP_10、SNP_11、SNP_12、SNP_13、SNP_14 存在杂合子情况（A），位点SNP_15、SNP_16、SNP_17、SNP_18 仅有纯合子的情况出现，不存在杂合子（B）。

2.2 各个基因多态位点与性状关联分析 18 个SNP 位点在产蛋性能性状的两尾样本中基因频率的差异结果如表3 所示，其中，300DEM 两尾样本中SNP_6 和SNP_14这2 个位点差异极显著；SNP_5 位点在两尾样本中差异显著。但是，将这3 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，只有位点SNP_14 仍然显著，其余位点均未达到显著水平。说明SNP_5 和SNP_6 是假阳性显著结果，可能是因为两组样本量较少。而SNP_14 经过重排检验后仍处于显著水平，说明其确实与300DEM 有一定的关联性。

表2 SNP 位点引物设计

图1 SNPs 位点散点图

针对300DBW 性能指标，在两尾样本中SNP_15和SNP_18 这2 个位点存在差异极显著；SNP_14 位点差异显著。但是，将这3 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，这些位点在两尾样本中差异均未达到显著水平。

FED 两尾样本中，SNP_12 位点在两尾样本中差异显著。对该位点的P值进行100 000 次重排检验后，该位点在两尾样本中的差异未达到显著水平。

FEBW 两尾样本中，SNP_1、SNP_3、SNP_7、SNP_14等4 个位点存在显著差异。但是，将这4 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，这些位点在两尾样本中差异均未达到显著水平。

MEM 上，SNP_10 和SNP_14 这2 个位点在两尾样本中存在差异极显著；SNP_1 位点和SNP_4 位点在两尾样本中差异显著。将这4 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，只有位点SNP_14 差异极显著；其余位点均未达到显著水平。

18 个SNP 位点在蛋品质性状两尾样本中基因频率的差异结果如表4 所示。其中，EW 两尾样本中，SNP_6、SNP_11、SNP_13 这3 个位点存在极显著差异。但是，将这3 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，这些位点在两尾样本中差异均未达到显著水平。

在YC 两尾样本中，SNP_15、SNP_18 这2 个位点存在极显著差异；SNP_6 位点在两尾样本中差异显著。但是，将这4 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，这些位点在两尾样本中差异均未达到显著水平。

AH 两尾样本中，SNP_6 位点差异显著。对SNP_6位点的P值进行100 000 次重排检验后，该位点在两尾样本中的差异未达到显著水平。

ESR 两尾样本中，SNP_1 位点存在显著差异。对SNP_1 位点的P值进行100 000 次重排检验后，该位点在两尾样本中的差异未达到显著水平。

ESS 两尾样本中，SNP_10 位点存在极显著差异；SNP_6 位点在两尾样本中差异显著。但是，将这2 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，这些位点在两尾样本中差异均未达到显著水平。

表3 各个基因多态位点与产蛋性能性状关联分析

表4 各个基因多态位点与蛋品质性状关联分析

ESI 两尾样本中，SNP_2、SNP_17 等两个位点差异显著。但是，将这2 个位点的P值进行100 000 次重排检验后，这些位点在两尾样本中差异均未达到显著水平。

3 讨 论

在鸡中，催乳素（Prolactin,PRL）参与多种特定生理过程的调节，如孵化行为的发生、性腺发育、排卵、渗透调节和免疫调节；已有研究发现PRL 通过其受体（Prolactin receptor,PRLR）的介导影响鸡就巢行为的发生从而间接影响产蛋性能[13-15]。本研究中PRL、PRLR基因与蛋重、浓蛋白高度、蛋壳强度、300 日龄总产蛋数、开产日龄、开产体重等性状显著或极显著相关。李丛艳[16]研究发现，位于PRLR 上的SNP_2（A25670G）与300 日龄产蛋量显著相关，SNP_3 与开产日龄显著相关，SNP4（A31900G）与就巢行为极显著相关，与本研究结果一致。

Feng[17]研究表明，在GHR基因外显子4 上游的内含子区存在许多与白来航鸡生产和生长性状相关的多态位点，并且GHR基因的突变对鸡的生长发育及腹脂沉积具有显著影响。本研究发现GHR基因上的SNP_15（G13557508A）、SNP_18（G13558144A）与300 日龄体重显著相关；此外，IGF-I基因上的SNP_3（T55320060A）与开产体重显著相关。同时，GHR和IGF-1基因是生长轴GH-GHR-IGF-I 通路的核心基因，因此推测这2 个基因对于生产性状的影响可能是通过生长轴通路实现的。

鸟类中的大量研究表明VIP（血管活性肠肽）调控禽类PRL 的释放，被称为PRL 的释放因子（PRF）。PRL 抑制卵泡刺激素和黄体生成素的释放，诱导和维持卵巢消退，并启动孵育行为。此外，卵巢的排卵刺激能够维持母鸡体内循环PRL 水平升高[18]。Zhou 等[11]对宁都三黄鸡的VIP基因上-2 648 bp 到-2 650 bp“AGG”插入缺失进行基因分型并进行性状关联分析，结果表明“AGG”插入缺失与90 d 至300 d 的卵总数和90 d 至300 d 的合格卵总数相关。在本研究中同样发现VIP基因上的SNP22（-49 584 027 到-49 584 029“AGG”插入缺失）与300 日龄总产蛋数、瑕疵蛋数显著或极显著相关，进一步表明VIP基因与母鸡繁殖性状相关。

脊椎动物中，生殖节律受脑-垂体-性腺（BPG）轴的调节。脑垂体分泌的促性腺激素（GtH）受到大脑释放的促性腺激素释放激素（GnRH）的调控[19]，GnRH 通过其受体（GnRHR）刺激垂体中促性腺激素的释放[20]，在繁殖调控中起重要作用。本研究中首次发现GnRHR基因上的SNP _1（G18251509A）位点与蛋型指数和开产体重显著相关，揭示了GNRHR介导的PBG 轴与母鸡生产性状存在潜在相关。

4 结 论

本研究运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测广西麻鸡9 个候选基因（GnRHR、IGF-1、NPY、PRL、ESRβ、ESRα、PRLR、VIP、GHR）中18 个SNPs位点多态性，通过100 000 次重排检验后，发现SNP_14与300 日龄总产蛋数和瑕疵蛋数仍旧保持极显著相关，同时发现共有14 个位点与蛋品质性状、生产性状存在一定的关联，这些SNPs 位点可为我国地方品种的标记辅助选择提供参考。