不同小麦品种的两种蛋白质含量测定方法比较分析

董松果,李浩,李东方,张胜利

（1.河南科技学院生命科技学院,河南新乡453003；2.河南省粮食作物基因组编辑工程技术中心,河南新乡453003；3.现代生物育种河南省协同创新中心,河南新乡453003）

小麦籽粒中的粗蛋白含量是小麦品质类型划分的重要依据之一,小麦品质的优劣在很大程度上影响其经济价值[1].小麦种子的蛋白质约85%～90%是储藏蛋白,主要分布于胚乳中.小麦面粉主要来自于小麦种子的胚乳,其蛋白质含量是小麦营养品质和加工品质的重要指标之一[2].目前,小麦蛋白含量测定有化学法和物理法,前者大多用常规的消煮+凯氏定氮法或者消煮+连续流动分析仪法[3-4],这些方法都具有较高的准确度,但是需要对试验材料进行消煮等繁杂的化学处理,比较耗时费力,同时试验中强酸、强碱的使用会造成一定的环境污染；后者常用的是近红外光谱法[5].作为一种无损、快速、高效的现代分析技术,近红外光谱技术（near infrared spectrum,NIRS）综合运用了光谱、计算机和化学计量学等多个学科的最新研究成果,在农业、工业、医疗健康等多个领域得到了越来越广泛的应用[6-9].美国谷物化学协会最早将近红外光谱技术应用在小麦品质检测中,用来测定小麦蛋白质含量和水分含量.随着光谱技术、计算机技术等的进步,近红外光谱检测技术也在不断发展,检测准确度和精度不断提高.瑞典波通公司生产的DA7250 型近红外测定仪是该公司推出的第三代二极管阵列近红外分析仪, 在前两代基础上进一步完善了相关软硬件,具有更快、更准、更稳定的特点.DA7250 采用固定全息光栅分光,铟镓砷二极管阵列技术,连续光栅光谱检测,并行处理所有波长信息,可检测水分、蛋白、脂肪、淀粉、纤维、灰分、氨基酸等参数.随着人们生活水平地不断提高,生产上对优质强筋小麦的需求日益增加.这对当前小麦生产上优质强筋品种的快速培育提出了更高的要求.

本研究以33 个小麦品种为材料,进行不同小麦品种蛋白质含量的常规化学测定方法和近红外光谱快速测定方法的比较分析,以期为小麦新品种培育中品质分析方法选择提供一定参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 小麦品种共计33 个（西农979、丰德存麦1 号、新麦26、陕253、小偃22、郑麦379、高优503、鲁麦21、山农12 号、济麦21 号、川麦36、小偃54、京冬22、中优9507、烟农15、温麦6 号、豫麦34、矮抗58、洛麦23、偃展4110、绵麦48、济麦22 号、石家庄8 号、新麦9 号、扬麦16、济麦19 号、皖麦19、京411、扬麦158、京冬8、漯麦18、轮选66、新麦35）,其中优质强筋小麦品种17 个,中筋品种16 个.试验材料种植于河南、陕西两个生态点,其中河南为两年数据.

1.1.2 仪器试剂 近红外测定仪为瑞典波通公司生产的DA7250 型；磨粉机为杭州大成光电公司生产的JMFD70×30 型；常规化学法测定所用仪器主要是德国Bran Luebbe 公司生产的AA3 型连续流动分析仪.化学试剂如硫酸、H2O2、NaOH、酒石酸钠、水杨酸钠、硝普钠等均为分析纯.

1.2 试验方法

1.2.1 近红外法 近红外法在小麦各品质参数的测定上应用较早[5],近红外测定仪更新换代也比较快,测定的准确度也在不断提高.本研究采用波通公司推出的第三代近红外光谱测定仪（DA7250 型）进行蛋白质含量测定.DA7250 型近红外测定仪测定小麦整粒种子的具体操作方法为：开机完成自检后点击“分析”按钮,再选择要分析的产品“wheat”,接着将小麦籽粒样品倒入样品盘,轻震使籽粒填满样品盘,用透明直尺将超过样品盘的部分刮出来,最后将样品盘放置在DA7250 的磁力盘上,点击“分析“按钮开始分析.样品ID 可以自动添加或用户手动添加.只需要数秒钟即可完成一个样品的分析,相关数据会自动保存备用.

1.2.2 常规化学法

（1）样品的准备与消解.待测小麦样品用近红外仪测定后用同一个磨粉机进行制粉,该磨粉机配备的网筛孔径为250 μm（约为60 目）,所制面粉样品符合GB/T 5506、GB/T 2057 等相关要求.将待测小麦面粉样品在烘箱中105 ℃烘干3 h,采用凯氏法处理面粉-硫酸与双氧水消解.秤取待测样品0.100 0±0.001 0 g,加入5 mL 硫酸进行消解,然后用去离子水定容至100 mL.每个样品设置一组3 个重复,每6 个样品设置一组空白试验,即不添加面粉样品,只加入5 mL 硫酸相同方法消解后定容至100 mL,摇匀后转移至离心管备测.

（2）AA3 型流动分析仪试剂配制.采用AA3 型连续流动分析仪进行消解后样品的N 含量测定,再根据小麦中的换算系数,折算成蛋白质含量.所需要配制的相关药品及方法分别为：

缓冲溶液：35.8 g Na2HPO4·12H2O,44.5 g NaOH,50 g 酒石酸钠,溶于去离子水中,定容至1 000 mL；

水杨酸：称取40 g 水杨酸钠,1 g 硝普钠（Na2[Fe（CN）5NO]·2H2O）,溶入去离子水并定容至1 000 mL；

NaClO：量取质量分数为5.25%的NaClO 溶液3 mL 定容至100 mL；

样品清洗液：量取硫酸40 mL 使用去离子水定容至1 000 mL.

（3）AA3 型流动分析仪测定.标准溶液的制备：用100 mL 容量瓶将质量浓度为1 000 mg/L 的铵态氮标准溶液与样品同等酸度硫酸溶液混合,配制质量浓度为0、1、2、5、10、20 和30 mg/L 的标准溶液.在测定前用流动分析仪测得标准曲线,以此为标准由吸光度值获得相应的质量浓度.

1.2.3 数据分析 主要采用Microsoft Excel 2010 进行相关数据分析.

2 结果与分析

2.1 两种蛋白质含量测定方法的相关性分析

不同筋度小麦品种的两种蛋白质含量测定方法的相关性见表1.

表1 不同筋度小麦品种的两种蛋白质含量测定方法的相关性Tab.1 Correlation between two methods for determination of protein content in wheat cultivars with different gluten levels

由表1 可知,不论生态间还是年际间,常规化学法和近红外法两者测定结果总体上看都是极显著相关；但根据品质指标分成不同筋度类型后进行相关分析,发现主要是强筋品种的相关性在年际间、生态间都极显著.这暗示在强筋小麦品种蛋白质含量检测上两种方法检测结果变化趋势相同,即不同生态地区进行强筋小麦育种时,可以用近红外检测法对后代群体的蛋白质含量进行快速无损检测,能够节省大量人力、物力,有助于加快强筋小麦育种进程,满足生产上人们消费水平的提高对小麦高品质品种的需求.而中筋小麦由于两者相关性不稳定,育种上应用近红外检测杂交后代的蛋白质含量时仅供参考,需要在后续种子量较大的世代进行化学法精确测定.

2.2 不同小麦品种两种测定方法蛋白质含量的相关性回归方程

不同生态点、不同筋度类型小麦品种两种测定方法所得蛋白质含量的相关性回归方程见图1、图2.

图1 陕西生态点不同筋度小麦品种的两种测定方法所得蛋白质含量的相关性Fig.1 The correlation between the two methods for protein content assayamong differentwheat cultivars with different gluten qualitygrown inShaanxi province

图2 河南生态点不同筋度小麦品种的两种测定方法所得蛋白质含量的相关性Fig.2 The correlation between the two methods for protein content assayamong differentwheat cultivars with different gluten qualitygrown in Henan province

由图1 和图2 可知,不同生态点、不同年度均表现为近红外法测定结果高于化学法,强筋小麦化学法测定蛋白质含量平均值为11.07%,近红外法为15.18%,这与两种方法测定样品状态不同有关,化学法所测为面粉样品,近红外法所测为整粒种子.按照面粉蛋白占整粒种子蛋白的85%计算,推导出的强筋小麦平均种子蛋白含量约为13.02%（11.07/0.85）,比近红外法测定结果的平均值低了约2 个百分点,这与李冬梅等[10]的研究结果比较接近.本研究发现,强筋小麦品种的两种测定方法虽然所测样品状态不同,但其相关性不管是年际间还是生态间都是极显著的,这为育种领域、粮食收储或加工领域的实际应用提供了一定的参考.本研究不同生态点、不同年度所有强筋小麦品种两种测定方法的相关性回归方程为：y=0.607 3x+8.452 5（其中x 为化学法所测值,y 为近红外法所测值,R2=0.606 2,r=0.778 6**）,所以可以根据该方程方便地计算出近红外法测定结果所对应的化学法预测值.经本研究所得数据测算,预测值与化学法实测值的差值占后者的比例为10.55%,也就是预测值的准确度大约为90%.对于中筋品种来说,不同生态点、不同年度总体来看,化学法测定蛋白质含量平均值为9.73%,近红外法为14.13%,两者差值与强筋小麦接近,但由于中筋小麦相对于强筋小麦来说不同生态点、不同年度两种测定方法的相关性均较差,因此在蛋白含量测定上,无损、快速检测的近红外法对中筋小麦品种参考价值一般.

3 结论与讨论

近红外光谱测定法作为一种无损、快速、高效的现代分析技术目前已经在包括农业在内的许多重要行业中有着广泛的应用[10-12].李冬梅等[13]研究认为8620、DA7200 两种型号的近红外仪在小麦面粉蛋白含量测定上都与传统的凯氏定氮法存在显著相关,可以应用这些近红外仪对小麦面粉蛋白质进行测定,并认为在F2 代性状分离的大量后代群体中可以运用DA7200 型近红外仪对个体的少量粉样测定进行早期预测.该研究没有根据不同小麦品种的品质差异进行分类分析.本研究发现,总体上两种蛋白质含量测定方法的相关分析所得结论与李冬梅等的结果是一致的,但进行不同筋度分类分析后发现,不同生态地区常规化学法和近红外法的相关性上,均是强筋小麦中极显著相关,而在中筋小麦中相关性不稳定.这暗示强筋小麦的蛋白质含量主要是受基因型控制,受环境影响较小,而中筋小麦在蛋白质含量上受环境影响较强筋小麦大[14].这与魏益民等[15]的研究结果基本一致.魏益民等对陕西省关中小麦品种区域试验的12 个小麦品种（品系）在12 个试点的数据资料进行了相关分析,发现基因型与环境互作、环境效应都对蛋白质含量影响较小,而基因型效应对包括蛋白质含量在内的所有品质参数均有显著影响.

随着光谱技术、化学计量技术、计算机技术等快速发展,近红外光谱测定仪也在不断进行更新换代.本研究采用波通公司推出的第三代近红外光谱测定仪——DA7250 型,对近红外光谱仪在不同小麦品种蛋白质含量快速、无损的检测进行了效果评价.研究结果证实,不同生态地区进行强筋小麦育种时可以用近红外检测法对杂交后代群体的蛋白质含量进行快速、无损检测,对小麦新品种培育,尤其是优质强筋小麦品种培育中品质分析方法选择具有一定参考价值.