胆酸钠自组装行为的小角X射线散射研究

2020-05-21李博楠李天富刘荣灯王子军刘蕴韬陈东风

光散射学报 2020年4期

李博楠，李天富，刘荣灯，王子军，刘蕴韬，陈东风

(中国原子能科学研究院，北京 102413)

1 引言

胆酸钠是胆汁酸中的主要成分之一，属于一种生物表面活性剂，具有促进脂溶性食物消化的作用[1-3]，同时，还通过调节某些基因影响脂肪、葡萄糖和能量代谢[4]。研究其在溶液中的自组装行为，对于理解其在分子层面上的生物学功能具有重要意义。与常见头-尾式柔性表面活性剂(例如十二烷基磺酸钠SDS，磷脂分子等)不同，胆酸钠具有类固醇刚性骨架，包含特殊的双亲面式结构[1-4]。在溶液中，分子间除了存在静电相互作用、疏水相互作用之外，还存在氢键相互作用[2]。这导致胆酸钠在溶液中表现出不同于SDS等常规表面活性剂的自组装行为。

目前，通过X射线衍射、动态光散射等技术手段已经对胆酸钠的基本参数、晶体结构进行了较为系统详尽的研究[5-8]。但对于胆酸钠在水溶液中的自组装行为机制尚不明确，无法给出准确的胆酸钠聚集数以及明确的聚集体模型。小角X射线散射技术可以原位、无损的测量介观尺度(1～100 nm)下存在电子密度起伏的微粒形貌、尺寸、分布等信息，是研究溶液状态下胆酸钠自组装行为的有力工具。已有学者通过小角散射技术对胆酸盐自组装进行研究[9-14]，但对于胆酸钠溶液自组装行为的系统实验研究还未见报道。

我们首先通过等温滴定量热法和Zeta电位测量初步确定了胆酸钠自组装行为机制随浓度升高而发生改变。通过同步辐射小角X射线散射技术，测量了一系列浓度的胆酸钠水溶液，发现了胆酸钠自组装行为驱动方式存在变化确定了胆酸钠自组装体存在最大尺寸，并给出了胆酸钠自组装体随浓度变化的形貌尺寸信息。

本文主要通过小角X射线散射技术辅以等温滴定量热法对胆酸钠在水溶液下的自组装行为进行研究，分析胆酸钠随浓度变化的自组装体形貌尺寸变化，讨论自组装体的形成机制。

1 实验

1.1 样品准备

实验所用的胆酸钠(NaC)样品从麦克林(MACKLIN)公司购得，用去离子水进行配置并静置以充分溶解。

1.2 小角X射线散射

小角X射线散射是一种研究材料微观结构的有力技术手段，其原位测量、对样品无损伤十分适合于研究溶液状态的样品。小角X射线散射实验(SAXS)在上海光源BL19U2生物小角线站上完成。测量参数选择如下，入射X射线的波长为1.08 Å，样品到探测器的距离为2.0 m，散射矢量Q范围为0.04到4.5 Å-1。将样品置于0.5 mL离心管中，用10 μm通径毛细管吸取至曝光位置。胆酸钠(NaC)浓度为0～100 mg/mL，分别对不同浓度的NaC溶液和缓冲溶液(去离子水)进行了测量，将测量结果按照监视器计数进行归一化处理。

1.3 等温滴定量热法

等温滴定量热法(ITC)是一种研究生物热力学与动力学的重要方法，该方法使用一台具有高灵敏、高自动化的可实时、连续、准确监测与记录一个完整变化过程中的热量变化的微量量热仪，可以获得原位、在线的热力学与动力学信息，同时对样品没有损伤。等温滴定量热实验是在清华大学蛋白质中心完成，实验仪器型号为MicroCal ITC200。实验测量参数为样品池注入300 μL去离子水，滴定针中为胆酸钠浓度62 mg/mL(135 mM)，温度设置为25 ℃，设定滴定次数40次，滴定体积1 μL，滴定间隔时间为120 s，搅拌速度为750 rpm，实验DP值设为5.0 μcal/s。

1.4 Zeta电位测量

Zeta电位是通过激光多普勒电泳检测样品散射光的微小频率移动，得到带电粒子电泳迁移率，利用Herry方程计算得到电位。Zeta电位用以表征胶体分散系稳定性。Zeta电位测量在哈尔滨工业大学应用化学实验中心完成测量，实验仪器型号为Zetasizer nano zs90。

2 结果与讨论

2.1 等温滴定量热法测量结果

通过ITC实验测量得到胆酸钠在水溶液中随浓度变化的量热信息，如图1所示。图中每一个峰代表每次滴定所产生的量热变化，其中向下的峰代表放热峰，向上的峰代表吸热峰。随着每次滴定，在这一过程中样品池中胆酸钠的浓度逐渐增加，可以得到胆酸钠浓度变化形成自组装体过程中量热的变化，发现在胆酸钠浓度范围为0～20 mg/mL，胆酸钠随浓度升高是发生连续的放热变化，这说明胆酸钠分子发生聚集形成自组装体放出热量。在浓度到达20 mg/mL附近是，吸放热到达平衡出现曲线中的明显拐点，但随着浓度继续升高，量热持续放生吸热变化，可以得出NaC自组装行为机制在拐点附近发生改变，判断是胆酸钠形成自组装体的驱动方式发生改变，由疏水相互作用主导的驱动方式逐渐转为由氢键相互作用主导的驱动方式，高浓度下胆酸钠刚性结构与双亲面式结构导致为了使自组装体自由能最少需要胆酸钠自组装体以氢键结合的方式聚集，这一过程中需要将已经由疏水相互作用结合的自组装体分解再形成以氢键结合的自组装体，这一过程会随着浓度升高而逐渐吸收热量。

图1 胆酸钠的ITC实验结果Fig.1 ITC results of Sodium cholate

2.2 Zeta电位测量结果

Zeta电位的大小表示胶体系统的稳定性趋势。如果悬浮液中所有粒子具有较大的正的或负的Zeta电位，那么他们将倾向于互相排斥，没有絮凝的倾向。但是如果粒子的Zeta电位值较低，则没有力量阻止粒子接近并絮凝。不同浓度胆酸钠的Zeta测试结果如图2所示。可以看出当胆酸钠浓度为20 mg/mL时，Zeta电位最低，达到-44 mV，体系处于最稳定状态，这与ITC测量结果中发现的拐点相吻合，说明此时由疏水相互作用为主的驱动方式与形成氢键为主的驱动方式达到了平衡，所以此时体系最为稳定。

图2 不同浓度胆酸钠的Zeta电位变化曲线Fig.2 Zeta potential curves of sodium cholate at different concentrations

2.3 小角X射线散射实验结果

采用小角X射线散射技术，测得不同浓度下胆酸钠在水溶液中的小角散射强度曲线I(Q)与散射矢量Q的一维曲线，如图3所示。随着胆酸钠浓度升高，小角散射强度逐渐增强。在低浓度下散射曲线整体升高且曲线形状发生明显变化，这表明胆酸钠在水溶液中发生了自组装行为。这与一般表面活性剂相似，在表面活性剂浓度达到临界胶束浓度(CMC)后，表面活性剂由于其亲疏水作用趋向于聚集在一起形成胶束，从而降低表面能，且自组装体会随着浓度升高继续增大或者改变聚集体形状。

图3 不同浓度下(4～100 mg/mL)，胆酸钠在水溶液下胆酸钠的小角X射线散射结果Fig.3 Small Angle x-ray scattering of Sodium cholate in aqueous solution at different concentrations (4-100 mg/mL)

为了进一步获得胆酸钠自组装体的结构信息，需要对散射数据进行模型拟合分析。通过计算给定模型的理论结果，再用非线性最小二乘法拟合实验数据，便可获得自组装体的结构信息。对于所研究的系统，SAXS强度分布I(Q)可以通过以下解析表达式给出：

I(Q)=A·P(Q)·S(Q)+Ibgd

(1)

其中A为反差因子，取决于电子密度的起伏，P(Q)为形状因子，S(Q)为结构因子。选取椭球形状因子[15]与HayterMSA结构因子[16]理论模型，可对胆酸钠一维散射强度曲线进行模型拟合分析。椭球形模型P(Q)表示为如下形式：

(2)

表达式中，scale为体积分数，V为散射体的体积，r是球体的半径，bkg为本底。

通过将理论模型导入SasView数据处理软件，利用非线性最小二乘法对所有数据进行了拟合分析。其中拟合形状因子参数包括非相干散射本底、椭球长轴、椭球短轴、反差因子，结构因子参数包括有效电荷、介电常数、盐离子浓度、温度以及体积分数。如图4所示，以40mg/mL胆酸钠散射强度曲线为例，将各组数据均拟合至收敛，可见理论模型与实验结果拟合结果相对较好。

图4 浓度为40 mg/mL的胆酸钠水溶液小角X射线散射模型拟合结果Fig.4 Small Angle x-ray scattering model of Sodium cholate solution at 40 mg/mL

通过对每组数据进行拟合得到胆酸钠受浓度影响的自组装体形貌信息。胆酸钠自组装体长轴半径在13.5-41.2 Å之间，短轴半径在9.6～11.4 Å之间。胆酸钠在低浓度为类球形，长短轴尺寸接近，随着浓度升高，短轴尺寸几乎无增长，长轴尺寸逐渐增大，在浓度达到40 mg/mL范围时，长轴尺寸增长逐渐变缓以至于不再继续增大，这说明胆酸钠自组装体存在最大尺寸(图5)。

图5 模型拟合方法得到的胆酸钠长短轴尺寸随浓度变化曲线Fig.5 Curve of Sodium cholate length and short axis size with concentration obtained by model fitting method

这与常规表面活性剂存在明显不同，且通过拟合得到的胶束带电情况和体积分数变化发现前后存在不同的自组装行为机制(图6、7)。

图6 模型拟合方法得到的胆酸钠体积分数随浓度变化曲线Fig.6 Curve of Sodium cholate volume fraction with concentration obtained by model fitting method

胆酸钠是由刚性的具有双亲性质的类固醇骨架构成，其刚性骨架亲水一侧上含有三个亲水的羟基基团，因此在水溶液中能够形成胶束等多种形式的聚集体。正是由于其非平面结构的双亲面式骨架具有刚性，导致在聚集体形成中存在由空间阻碍效应影响而无法形成较大的聚集体，从而使得聚集数相较于一般表面活性剂少，所以胆酸钠自组装体存在最大尺寸且相较于常规表面活性剂更早的出现由结构因子引起散射峰。