单链DNA表面增强拉曼散射检测条件的优化

蒋承顺，李旺，柳艳，陆峰,*

(1.福建中医药大学药学院，福州 350122；2.海军军医大学药学院，上海 200433)

1 引言

DNA即脱氧核糖核酸，由脱氧核苷酸组成，具有复杂的结构。每个脱氧核苷酸都由磷酸、脱氧核糖和含氮碱基组成。其中，含氮碱基又分为腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T四种类型。四种含氮碱基含量与排列顺序的不同决定了遗传物质的多样性。作为大多数生物的遗传信息载体，对DNA的研究一直是科学研究的热点之一。

传统的DNA分析方法，如聚合酶链反应和微阵列技术，通常需要荧光标记，不仅程序复杂、成本较高，还会导致DNA分子内在化学结构信息出现损失。而目前建立的检测分析技术常涉及DNA标靶的标记和杂交后标记，使检测过程更加复杂[1,2,3]。表面增强拉曼光谱是一种超灵敏的检测方法，当分子与粗糙的贵金属表面接近时，可产生强Raman散射信号[4,5]。许多学者运用SERS对DNA进行检测和分析。Papadopoulou[6,7]用硫醇化修饰DNA，使之附于金属粒子表面，得到了增强的拉曼信号。而后发现在Ag胶基底中加入一定量的MgSO4能够促进Ag纳米颗粒的聚集从而获得DNA的SERS光谱，而不需要对DNA进行硫醇化。2015年，Xu[8]等人用碘化钾修饰Ag纳米颗粒(Ag IMNPS)，同时添加MgSO4以中和表面电荷并增强DNA与Ag纳米颗粒的相互作用，在模仿人生理环境的溶液中检测到具有高度可重复性的拉曼信号。该方法操作简单，不需要特殊的基底，能检测到丰富的信号且重现性较好。因此，本文以此方法为基础，进一步优化SERS对ssDNA(single-stranded deoxyribonucleic Acid)的检测条件。

已有的文献研究中，SERS检测ssDNA常使用大型且昂贵的台式显微共聚焦系统，有时不能满足快速现场检测的需求。相比之下，便携式拉曼光谱系统具有易于携带、操作简便、快捷、价格低的优点，在现代分析中应用越来越广泛。然而，以Ag IMNPS为基础的方法却不直接适用于便携式拉曼系统对DNA的检测。因此，本文对该方法的检测条件进行优化，使其适用于便携式拉曼光谱系统，并对优化后的方法进行稳定性、重复性和检测限的考察，还对检测结果进行峰位归属，为便携式拉曼光谱系统检测ssDNA提供一种新的方法基础。

2 材料与方法

2.1 样品与试剂

单链DNA GO18(序列为AACCTTTGGTCGGGCAAGGTAGGTT (5′～3′))，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸银(AgNO3)、柠檬酸三钠(Na3C6H5O72H2O)、硝酸(HNO3)均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；碘化钾(KI)、硫酸镁(MgSO4)均为分析纯，购自上海泰坦科技股份有限公司；其他实验耗材均购于探索平台；实验用水为去离子水。

2.2 仪器与设备

便携式拉曼光谱仪(BWS415-785H)，激光激发波长785 nm，分辨率5 cm-1，配有放大倍数为20倍的物镜，购自美国必达泰克公司；双光束紫外可见分光光度计(TU-1902)，购自北京普析通用仪器有限责任公司；高速离心机(TG16-WS)，购自上海卢湘宜离心机有限公司；扫描电子显微镜(Zeiss EVO MA-10)，购自德国Carl-Zeiss公司；多功能旋涡混合器(Vortex-Genie2)，购自美国Scientific Industries 公司；实验室纯水系统(Smart-D UV)，购自上海和泰仪器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S)，购自上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；电子天平，购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；圆底烧瓶，冷凝管等。

2.3 纳米银胶的制备与表征

本实验采用经典的Lee法制备纳米银胶[9]。首先，精密称取36 mg的硝酸银，溶于200 mL的去离子水中，倒入500 mL三颈烧瓶内，加热并磁力搅拌，当溶液微沸时，保持搅拌状态，将4 mL质量分数1%的柠檬酸三钠水溶液缓慢加入，继续回流搅拌加热60 min，可以观察到溶液的颜色逐渐由无色透明变为深棕色，最后变为淡黄色并略显绿色，停止反应后室温冷却，即得到粒径约为50 nm 的纳米银球，最后倒入干净的棕色瓶中避光保存。由于银胶属于介稳体系，因此每次取用纳米银胶时，均需摇晃均匀。取银胶原溶液1 mL离心(5000 r/min，5 min)，除去上清液，用等量去离子水复溶，再加去离子水至5 mL，然后在300～500 nm波长范围进行紫外扫描。取银胶原溶液1 mL离心(5000 r/min，5 min)，除去上清液，加去离子水至1 mL，取2～3 μL滴于硅片上，在红外灯下照射，待溶剂挥发完全后进行电镜扫描。

2.4 待测体系的配制

单链DNA初始为粉末状，加入去离子水配制成浓度为50 μM的母液，置于-20℃的冰箱中储存。精确称取KI粉末16.6 mg溶于100 mL去离子水中，得1 mM KI溶液。精确称取MgSO4粉末60 mg溶于50 mL去离子水中，得10 mM MgSO4溶液。基于参考文献[8]并适当改变，用移液枪取2.5 μL浓缩胶，向其中精密加入2.5 μL 1 mM的KI溶液，涡旋，使其充分混合，并在室温下孵育20 min，以确保KI完全清洗AgNPs表面。然后加入2.5 μL DNA溶液和适量10 mM的MgSO4溶液充分混合，再加去离子水至50 μL，混匀即得。

2.5 SERS检测条件的优化和检测方法的确定

为了获得更加灵敏的信号，同时阐明不同检测参数对单链DNA SERS图谱的影响，分析单链DNA GO18在便携式拉曼光谱仪的不同检测条件下的SERS谱图。试验参数设置为：银胶浓缩倍数50倍、100倍和150倍；激发功率为30%(60 mW)、50%(100 mW)、80%(160 mW)；积分时间为10 s、20 s、30 s；扫描次数为1次；显微系统放大倍数为20倍；装样方式为96孔板、高纯度石英毛细管1.0～0.8(外径1.0 cm，内径 0.8 cm)、1.0～0.7、1.75～0.9)；凝聚剂MgSO4(10 mM)用量0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL。分析不同试验参数对SERS结果的影响，以获得优化的检测条件。

2.6 数据处理

采用BWSpec4软件对采集的原始光谱进行平滑(savitzky-golay平滑)、基线校正(airPLS法)等处理。然后用MATLAB 13.0软件对数据做进一步的处理，使其能够用于Origin 8.5软件进行绘图。由于光谱波段400 cm-1之前和1800 cm-1之后几乎没有光谱特征，因此选取光谱波段400～1800 cm-1进行绘图分析。

3 结果与讨论

3.1 纳米银胶的表征

对制得的银胶原溶液进行紫外扫描和电镜扫描。扫描电镜显示所制得的纳米银胶颗粒呈直径为50 nm的球体状态，且大小分布较为均一。紫外扫描只在410 nm处出现了一个尖锐的单峰，且其半峰宽较小，反映出纳米银胶颗粒具有良好的分散性与均一性，能够满足试验的需要。

3.2 银胶浓缩倍数的优化

选择合适的银胶浓缩倍数是SERS实验顺利实施的一个重要因素。本实验配制了浓缩50倍、100倍和150倍三种浓缩胶，在其他条件相同的情况下，探究浓缩倍数对SERS检测结果的影响。图1的结果表明：浓缩100倍与50倍的检测信号强度相似，但前者能更快检测到稳定的信号，而浓缩150倍的银胶未能出现正常的ssDNA SERS信号。原因可能是：50倍浓缩胶中，银纳米颗粒的量相对较少，不能够最大程度地增强ssDNA的SERS信号，而且较少的银纳米颗粒需要更多时间聚沉到稳定状态；100倍浓缩胶中银纳米颗粒的数量相对充足，能够最大程度地增强ssDNA的SERS信号，且较多的银纳米颗粒能够更快地聚沉至稳定状态，更快检测到稳定的SERS信号；150倍浓缩胶中的银纳米颗粒数量过多、易聚沉，导致银胶本身的信号较强，而ssDNA反而不易与银胶接触，导致ssDNA的信号变弱而被银胶本身的信号掩盖，出现了异常峰信号。总之，银胶浓缩100倍时，能更快地检到稳定且强度大的SERS信号。

图1 不同银胶浓缩倍数检测结果Fig.1 Testing results of different silver sol concentrations

3.3 装样方式的优化

不同装样方式对检测结果有较大影响，文献[8]中使用96孔板进行检测，该方式所需要的样品量大且待检体系易于沉淀，所以尝试选用高纯石英毛细管装样。考虑到不同内外径毛细管管壁不同，单位激光照射面积上的液体体积不同可能对检测结果有影响，选用三种不同内外径毛细管1.0～0.8(表示该高纯石英毛细管外径1.0 cm，内径0.8 cm，下同)、1.0～0.7、1.75～0.9进行检测并与96孔板相比较。96孔板的检测结果峰信号很弱，原因是96孔板中待检体系出现明显沉淀，导致激光照射处ssDNA和银纳米颗粒浓度较低。1.75～0.9毛细管的信号也明显低于1.0～0.7和1.0～0.8毛细管，可能是因为1.75～0.9毛细管的管壁较厚，降低了入射激光的效率导致检测信号较弱。1.0～0.8和1.0～0.7毛细管的检测结果基本相同，但考虑到1.0～0.8毛细管的内径更大，更有利于移液枪进样，所以后续都使用1.0～0.8毛细管装样。

3.4 激光功率和积分时间的优化

由于激光功率和积分时间对SERS检测结果有比较大的影响，所以对二者同时进行优化。首先，选择三个常用激光功率(30%(60 mW)、50%(100 mW)和80%(160 mW))和三种积分时间(10 s、20 s、30 s)，再将二者进行两两组合，即对9种检测条件进行比较。激光功率-积分时间为10 s-30%、10s-50%和20s-30%的峰信号较弱，而20s-80%、30s-50%、30s-80%的峰信号超出量程，所以这6种条件加以排除。对10s-80%、20s-50%、30s-30%这三种检测条件进行筛选(图2)，10s-80%的强度略低于20s-50%和30s-30%，而后两者强度几乎无差别，但是激光功率为30%(60mW)时，对低浓度样品的检测更有优势，检测限更低，所以最终选择30s-30%作为优化条件。

图2 激光功率-积分时间检测结果筛选Fig.2 Screening of laser power-integration time detection results

3.5 凝聚剂MgSO4加入量的优化

在检测体系中加入MgSO4，可以中和Ag IMNPS表面电荷并增强ssDNA与Ag IMNPS的相互作用，从而能够检测到强烈且可再现的SERS信号[8]。加入MgSO4量的多少对检测结果有较大影响，所以考察其加入量。在检测体系的配制过程中，分别加入MgSO4(10 mM)0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL进行检测，结果如图3。可见加入0.5 μL、1.0 μL MgSO4的信号较弱，可能是因为MgSO4的量不能够使Ag IMNPS与ssDNA充分凝聚。加入MgSO4体积为2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL的峰信号强度无明显差别，说明2.0 μL MgSO4就足够使得Ag IMNPS与ssDNA充分凝聚，再增加MgSO4反而可能会因为凝聚剂过多，使得检测体系出现沉淀，影响检测结果。因此，加入2.0 μL MgSO4(10 mM)是最优的条件。

图3 不同MgSO4加入量的检测结果Fig.3 Testing results of different MgSO4 addition amount

综上，便携式拉曼光谱仪对单链DNA检测的最佳条件为：银胶浓缩100倍，高纯石英毛细管 1.0～0.8(外径 1.0 cm，内径 0.8 cm)装样，激光功率30%(60 mW)，积分时间30 s，凝聚剂MgSO4(10 mM)2.0 μL。

3.6 方法学考察与峰位归属

3.6.1重复性考察

按照优化后的条件，对同一浓度待测体系进行6次检测，检测体系中样品浓度为2.5 μM，每次取稳定后的光谱图进行重复性的检验。拉曼位移在788cm-1处出现最强峰，归属于PO2-的骨架伸缩振动，以该峰峰强计算RSD值，结果为4.72%，显示该方法重复性较好。

3.6.2稳定性考察

按照优化后的条件，对同一待测体系进行了连续的SERS检测，检测体系中样品浓度为2.5 μM，每次测量间隔为0 s，共采集120张光谱。图4为第1、2、3、4、5、10、20、40、60、80、100、120张光谱图，可见前5张图谱信号一直上升，然后趋于稳定(即检测150s后)。主要原因为：在加入MgSO4之后，激光照射下银纳米颗粒的聚集加快，前5张图谱是在凝聚点到达稳定过程中检测的，随后纳米颗粒聚集达到稳定状态，信号也随之稳定。

图4 同一样品采集120次部分谱图Fig.4 Part of 120 spectra from the same sample

3.6.3检测限考察

按照优化后的条件，采用倍比稀释法配制了ssDNA终浓度为5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.313μM的检测体系，如图5所示，拉曼位移在1094 cm-1处出现最稳定特征峰，文献中已有报道其为ssDNA中磷酸骨架的特征峰，以此峰计算检测限。当样品最终浓度为0.625μM时，S/N>3；终浓度为0.313μM时，S/N<3，因此0.625μM可作为检测限。该浓度已低于大多数文献报道的SERS测定DNA的浓度，说明优化后的方法具有一定优势。

图5 不同样品浓度检测结果Fig.5 Testing results of different sample concentrations

3.6.4峰位归属

文献中对ssDNA的SERS峰位进行了初步的归属但并不详细，而且由于方法的改进及选用仪器的改变，可能会与已有报道的峰位归属存在一定的偏差，所以需要对优化条件所得到的SERS图谱重新进行峰位归属。

首先设计了存在单一碱基类型的单链ssDNA序列，即在一条 ssDNA 链中所有的碱基类型都为A或T或C或G，即A11、T11、C11、G5(下标表示碱基个数，需要注意的是，在单链ssDNA的合成中，一条链中连续G的个数不能超多5个，因此，G5的碱基个数为5个G，其他序列为11个同种碱基)。然后分别进行SERS检测，与样品检测结果进行归一化后相对比。

图6为A11、T11、C11、G5以及GO18的SERS光谱图，可以看出，四种不同的ssDNA具有丰富且独特的SERS指纹信息。它们在1094cm-1处(归属于PO2-的对称伸缩振动)显示出共同的SERS强峰，在788 cm-1附近也能观察到明显的由PO2-骨架伸缩振动所产生的SERS峰，表明在该待测体系中磷酸骨架非常接近Ag IMNPs表面，从而产生增强的拉曼信号。A11的SERS光谱在730 cm-1处出现腺嘌呤的主要特征峰，来源于腺嘌呤的环呼吸振动。T11的SERS光谱图在745 cm-1的峰为胸腺嘧啶的SERS特征峰，来源于胸腺嘧啶的环呼吸振动，同时1649 cm-1也出现胸腺嘧啶强的特征峰。对于C11的SERS光谱，其只在683 cm-1左右出现较小的特征峰，而在790 cm-1处出现一强峰，该峰并不完全来源于胞嘧啶的环呼吸振动，而是由于C的环呼吸振动所产生，它与磷酸骨架伸缩振动所产生的788 cm-1处的峰拉曼位移比较接近，两者重叠后在791 cm-1左右处出现很强的包埋复合SERS峰。对于G5的SERS光谱，在683 cm-1、1325 cm-1、1487 cm-1、1576 cm-1处存在其主要的特征峰，分别对应G环的呼吸振动、dG C2′-endo/syn、dG N7 H-bond to H2O、dG δNH (N2HH-bond to H2O)。另外，800 cm-1～1150 cm-1范围内也具有较为丰富的SERS峰，来源于磷酸骨架和脱氧核糖的分子振动。

图6 样品与单碱基单链DNA检测结果Fig.6 Testing results of the sample and the single-base ssDNA

与文献相比，可以很明确地发现方法的改进与检测仪器的改变会对ssDNA的SERS峰位归属产生一定的影响(如文献中PO2-的对称伸缩振动在1087cm-1处出峰，而本文所测得的峰为1094cm-1)，主要体现在峰位的小幅度偏移，以及个别峰的强度差异上。但同时也可以表明该方法可以真实地反映ssDNA的基本结构组成的指纹信息，包括碱基、磷酸骨架及脱氧核糖，进一步证明了该方法具有较高的可靠性与一定的应用前景。

通过对四种不同单一碱基类型的ssDNA的分析，以及参照已有文献对各种ssDNA的SERS峰位归属，本文对改进的SERS方法检测GO18得到的峰位进行了更加完善详细的归属(表1)。

表1 GO18的SERS峰归属Table.1 The SERS peak position assignment of GO18

4 结论

本文以GO18为例，研究银胶溶液浓缩倍数、激发功率及积分时间、装样方式、凝聚剂MgSO4的用量等不同检测条件对单链DNA的SERS检测结果的影响，确定了最佳的检测条件。该条件下，方法稳定性和重复性好，峰位归属明确，检测限达0.625 μM。本研究为进一步扩大和推动SERS技术在单链DNA检测中的应用提供了方法基础。