气相分子吸收光谱法测定奶粉中蛋白质的含量

(上海安杰环保科技股份有限公司，上海 219000)

牛奶是多种物质(乳糖、脂质、蛋白质、氨基酸、尿素、肌酐等)的混合物，其成分取决于多种因素，例如基因育种计划，喂养计划和气候条件等。在过去的几年中，奶酪的消费量增加了，因此奶粉中蛋白质含量的测定是该行业的商品价格设置的重要因素。利用分光光度法测定总蛋白通常用于多个领域，例如临床分析、生物化学、生理学、医学研究以及许多其他领域。利用凯氏氮法检测不能区分牛奶中添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质，但是有研究人员发现用乙酸锌溶液做沉淀剂，使蛋白质沉淀，可以分离蛋白质与非蛋白氮，随后再用凯氏定氮法测定蛋白质的含量[1,2]。尽管凯氏定氮法存在两个主要问题，即完成整个测定需要很长时间，并且有必要进行两次分析以确定非蛋白质氮(NPN)和总蛋白氮(TPN)之间的差异，但是它在食品科学和技术中被广泛使用，是官方认可的标准参考方法[3-5]。因此，建立快速的奶粉中凯氏氮的分析测定方法既有利于研究人员的工作效率，也可以有效的避免食品安全问题的发生。

现有的奶粉中蛋白质的分析标准方法主要有《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[1]，该标准方法所用原理都是基于分光比色法，样品消化之后还需要蒸馏吸收，滴定等步骤，耗时耗力；实验结果容易受试验人员手工误差等因素的影响。气相分子吸收光谱法是20世纪70年代兴起的一种简便、快速的分析手段。它具有测定结果准确可靠、测定成分浓度范围宽、抗干扰性能强、不受样品颜色和混浊物的影响，不需要进行复杂的化学分离；所用化学试剂少，不使用有毒特别是易致癌的化学试剂，是一种不产生二次污染的新颖分析技术。该方法已广泛应用于水质凯氏氮的分析测定[6]。本研究参考《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》方法的食品中凯氏氮的消化方法，消化后的上清液进行气相分子吸收光谱法的测定，为奶粉中凯氏氮的分析提供一种新型的分析方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相分子吸收光谱仪，AJ-3700，上海安杰环保科技股份有限公司；天平，百分之一天平(杭州万特衡器有限公司)。

硫酸铜、硫酸钾、硫酸、无水乙醇、盐酸、次溴酸盐等(国药集团)，以上药品均为分析纯。

氨氮标准溶液；控制样标准溶液等，4℃下密封保存。

1.2 奶粉样品

随机购买两份奶粉样品，样品1为雀巢脱脂奶粉(蛋白质含量：21.0g/100g)，样品2为雀巢中老年奶粉(蛋白质含量：27.0g/100g)，样品3为奶粉中蛋白质标准物质，其商品编号为：BW3832-2 ，蛋白质的标准值为:22.84% 相对扩展不确定度(k=2)(%)为6.0。

1.3 仪器工作条件

气相分子吸收光谱仪工作温度20～30℃，环境湿度≤80%；氘灯光源，灯电流300mA，气源压力0.2Mpa；载流液为盐酸(1+3)；PMT负高压260V，测量方式：峰面积。

1.4 方法原理

1.4.1奶粉中总蛋白氮

将奶粉中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，用次溴酸盐氧化法，将待测物质中的氨氮氧化为亚硝酸盐氮，并最终生成二氧化氮气体，通过载气将二氧化氮气体载入吸光管进行吸光度检测，进而得出奶粉中总蛋白氮的含量。

1.5 试验方法

准确称取1.0g奶粉样品(精确至0.001g)于250mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20mL硫酸，小火加热，等奶粉样品完全炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持烧瓶内液体微沸，直至溶液变成蓝绿色澄清透明，再加热0.5h，取下放冷，缓慢加水20mL，定容于100mL容量瓶中，混匀备用。移取稀释后的上清液于50mL样品管中，在仪器最佳工作条件下上机测试，按照同一方法做试剂空白试验。

总蛋白质氮按照国标方法进行计算，氮换算为蛋白质的系数为6.38[1]。国标方法的测定用《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》方法中的凯氏定氮法进行测定。

2 结果与讨论

2.1 线性范围

2.1.1标准曲线

配置浓度为0.0000mg/L、0.1000mg/L、0.2000 mg/L、0.5000mg/L、1.0000mg/L、2.0000mg/L氨氮标准系列溶液，从低浓度到高浓度进行测试。以吸光值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，拟合得到氨氮的标准曲线。如图1所示，标准曲线的线性方程为y= 0.118110x+ 0.003283,r= 0.99941，线性系数完全满足一般实验室对于分析的要求。

图1 氨氮测定标准曲线

2.2 检出限

2.2.1仪器检出限

将产生两倍噪声信号时，单位体积载气或单位时间内进入检测器的组分量称为检出限。则检出限的计算公式为：

D= 2N/S

式中：N—噪声(mV或A)；

S—检测器灵敏度；

气相分子吸收光谱仪器的噪声为0.0001V,检测信号为0.1500ABS, 仪器定量限一般为10倍信噪比，因此该仪器对的检出限为0.0067 mg/L。

2.2.2方法检出限

利用气相分子吸收光谱仪重复重复测定消化后的空白样品7次，然后计算 g该方法的检出限，计算公式如下：

MDL=S×t(n-1,1-a=0.99)

式中：n=重复测定的样品数，S=n次加标测定浓度的标准偏差，t=自由度为n-1时的Student's t值(可查表得到)，1-a为置信水平，结果如表1所示，计算出本方法对凯氏氮的检出限为0.0191 mg/ kg。

表1 空白样品测定结果 (n = 7)

2.3 精密度测试及结果

2.3.1凯氏氮

采用气相分子吸收光谱法对样品1、样品2奶粉中凯氏氮的含量，进行7次测定，结果如表2所示，气相分子吸收光谱法测定相对标准偏差在0.49%～0.72%之间，精密度良好。其中样品1消解液稀释500倍，样品2消解液稀释200倍，样品3消解稀释液稀释400倍。试样中蛋白质的含量(g/100g)=凯氏氮的质量*氮换算为蛋白质的系数*100。其结果如表3所示，利用该方法测定的奶粉中蛋白质的标准样品结果符合样品要求。所购买的奶粉样品的测定结果与商品的营养成分表中的蛋白质含量差别较小。

表2 仪器精密度测试结果 (n = 7)

表3 奶粉中蛋白质含量结果

2.4 加标回收率测试

2.4.1凯氏氮

根据上述样品凯氏氮含量测试结果进行加标回收率测试，测定结果如表4所示，本方法检测奶粉中凯氏氮加标回收率为96.35%～100.99%。表明实验方法得准确度较高，适用于奶粉中蛋白质(凯氏氮法)的检测分析。

表4 加标回收实验结果 (n=7)

2.5 与国标方法比较及样品测试结果

利用国家标准方法-第一法：凯氏定氮法测定以上实际购买的奶粉样品及标准样品的蛋白质含量。将消解液按照国标方法取10mL进行碱化蒸馏，使样品中氨游离, 用硼酸吸收后利用盐酸标准溶液(0.0521mol/L)进行滴定，根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量。结果如表5所示。

表5 国家标准方法测定奶粉中蛋白质含量的结果

注：V1，V，V3为国标方法一的注释

由表5可以看出，利用国标方法检测奶粉标准物质样品测得的结果为22.8g/100g蛋白质含量；而利用气相分子吸收光谱仪器测定的该标准物质的结果为22.84g/100g，利用仪器的方法测定7次，RSD为0.21%，结果更加精确。虽然两个方法的结果差别在合理的范围，但是在国标法蒸馏及滴定过程中，操作时间更长，会存在试验人员的手工误差，从而影响试验的结果。选择气相分子吸收光谱仪器来完成这项工作更加便捷。

3 结论

本研究建立了基于气相分子吸收光谱法的奶粉中蛋白质的定量分析方法。本方法的检出限较低，加标回收率在96.35%～100.99%范围，相对标准偏差在0.49%～0.72%范围，与国标方法相比减少了样品碱性蒸馏以及滴定等工作，大大提高了工作效率，减少了样品前处理操作的消耗，减少了试验人员的滴定操作的手工误差。利用新方法测定的结果线性范围宽，分析灵敏度高，而且样品消解后可以直接利用全自动的气相分子吸收光谱仪进行测定，操作简单高效。本工作为奶粉中蛋白质凯氏氮法的测定提供了一种新颖的测试手段，也为气相分子吸收光谱法在食品领域的应用拓展提供了重要参考依据。