大鲵肉酶解肽抗氧化及免疫活性研究

贺屹潮， 金文刚，2*， 陈德经,2， 杨 慧

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000)

大鲵(Andriasdavidiauns)为两栖动物，全身是宝，其皮肤、皮肤分泌物、肌肉、骨骼含有很多生物活性物质，具有较高的营养和药用价值，素有“水中活人参”之称[1]。大鲵肉蛋白质含量为17.21%，粗脂肪为1.30%，灰分为1.01%，水分为80.40%，大鲵肉蛋白质中含有8种人体必需氨基酸，含量在32.5%，人体必需氨基酸指数(EAAI)为91.53[2]，大鲵肉中含有14种脂肪酸，其中多不饱和脂肪酸含量为35.80%，DHA、EPH含量分别为4.54%、6.68%[3]，大鲵体内钾含量310 mg/100 g，钠62 mg/100 g，磷196 mg/100 g，钙16.22 mg/100 g，锌1.60 mg/100 g，铁0.5 mg/100g，铜0.07 mg/100 g，每100 g肉提供的硒可达0.04 mg[4]。近年来，人工养殖大鲵在我国形成了规模化，年繁殖500万尾，存养商品鲵3000万尾，养殖规模的增大导致商品鲵价格不断下滑[5]。大鲵的直接食用受到加工、运输等限制，且一般的肉制品加工附加值低。因此，需要对大鲵肉进行高附加值加工利用，以提高大鲵肉的加工效益。

食源生物活性肽通常由2～10个氨基酸组成，具有抗氧化、免疫调节、增强记忆、改善元素吸收等生物活性，是一类低敏、无毒、安全性高的蛋白片段，在人类营养健康和疾病调节方面显示出广阔的发展前景[6-7]。食源生物活性肽的制备方法主要是酶解法，具有操作条件温和、易控、安全性高等特点。食源蛋白质酶解肽的功能性如溶解性、乳化性、起泡性通常要优于原蛋白[8]。

大鲵肉具有营养滋补作用，但增强免疫作用缺乏系统的实验研究。为此，本研究利用酶解法制备大鲵肉酶解肽，鉴定其抗氧化和免疫调节活性，为大鲵高附加值多肽产品开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料：汉中大鲵，购于汉中市龙头山水产养殖开发公司养殖基地。

主要试剂：碱性蛋白酶、风味蛋白酶，购于广西南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶，购于上海生工生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)购于SIGMA公司；抗坏血酸；DMEM培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、青霉素-链霉素溶液(Penicillin-Streptomycin)、胰蛋白酶-EDTA(0.25%)、酚红(Trypsin-EDTA，phenol red)等，购于美国Corning公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA320413电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；AD500S-H型实验室数显分散均质机，上海昂尼仪器仪表有限公司；pHS-3C型pH计，上海雷磁仪器厂；UV2100型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；SYKAM433D氨基酸分析仪，苏州华美辰仪器设备有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州集团安泰空气技术有限公司；MCO-15AC型CO2恒温培养箱，三洋电机株式会社；5702R型低速离心机，Eppendorf生命科学公司；MULTISKAN MK3型酶标仪，赛默飞世尔科技公司。

1.3 方 法

1.3.1 原料预处理

鲜活大鲵，宰杀后去皮、去可见脂，于绞肉机中绞碎为肉糜。

1.3.2 酶解工艺流程

肉糜按1∶3料液比加入蒸馏水→恒温水解6 h→冷却至室温→10 000 rpm离心10 min→取上清→浓缩→冷冻干燥→天然肽。

提取天然肽后的肉→加水调pH值(碱性蛋白酶：pH 8.0，温度55 ℃；风味蛋白酶：pH 7.0，温度50 ℃；胰蛋白酶：pH 7.0，温度50 ℃)→2500 U/g加酶→恒温水解3 h→沸水浴灭活→冷却后调pH至中性→10 000 rpm离心10 min→透析→浓缩→冷冻干燥→酶解肽样品。

NP：大鲵肉天然肽；APP：碱性蛋白酶酶解肽；FPP：风味蛋白酶酶解肽；TP：胰蛋白酶酶解肽。

1.3.3 水解度测定

采用pH-stat法进行水解度测定，依据酶解过程中加入体系用于维持pH值恒定消耗的碱液体积直接计算[9]，其计算公式为

DH(%)=[B×Nb/(Mp×α×htot)]×100%，

式中DH为水解度，%；B为消耗的碱的体积以维持pH不变，mL；Nb为碱的浓度，mol/L；Mp为底物中蛋白总量，g；htot为底物中肽键总数，mmol/g，本研究中以7.5计；α为水解过程中α-氨基的解离度，计算公式为α=10pH-pK/(1+10pH-pK)。

1.3.4 酶解肽分子量测定

采用凝胶渗透色谱(GPC)结合内标法，计算酶解产物中不同分子量范围所占比例[10]。

1.3.5 抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

实验方法参考文献[11]，取3 mL酶解肽稀释样品(2、4、6、8、10 mg/mL)于试管中，再加入3 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混匀后避光反应30 min，用去离子水进行调零，用紫外可见分光光度仪测定517 nm处的吸光度，记录数据并计算不同浓度样品溶液对DPPH自由基的清除率。对照采用抗坏血酸(0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL)，其清除率计算公式为

清除率(%)=(A0-A)/A0×100%，

式中A0为3 mL去离子水+3 mL DPPH的吸光度，A为3 mL样品溶液+3 mL DPPH的吸光度。

清除率(%)=[1-(A-A0)/A1]×100%，

式中A为样品组吸光度,A0为对照组吸光度,A1为空白组吸光度。

1.3.5.3 亚铁离子螫合能力

测定方法参考文献[13]，取1 mL酶解肽稀释样品(0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL)于试管中，与50 μL 2 mmol/L氯化亚铁溶液和1 mL去离子水混合均匀后室温静置5 min，加入100 μL 5 mmol/L菲咯嗪溶液，室温静置5 min后，在2000 r条件下离心10 min，测上清液在562 nm下吸光值。对照采用EDTA-2Na(0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL),其螯合率计算公式为

鳌合率(%)=[1-A/A0]×100%，

式中A为样品组吸光度，A0为用等体积去离子水代替样品后吸光度。

1.3.6 免疫活性测定

测定方法参考文献[14]，取处于对数生长期，生长状态良好的RAW264.7细胞，按5000个/孔接种于96孔板中，每孔加入培养液100 μL，置37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中培养过夜；按照50、100、200、400 μg/mL组，细胞培养所需48 h后，每孔加入10 μL MTT，37 ℃培养4 h；加入150 μL DMSO震荡10 min；测定各孔吸光值OD568，其增殖率计算公式为

增殖率(%)=[(A-A1)/(A0-A1)×100-A0]×100%，

式中A为样品组吸光度,A0为正常细胞组吸光度；A1为空白组吸光度。

2 结果与分析

2.1 水解度曲线

经不同蛋白酶酶解，酶解肽的水解度随水解时间变化曲线见图1。由图可见，随时间的增长，90 min前水解度显著上升，原因可能是因为在0～90 min时，随着时间的变化，蛋白质空间结构被破坏，蛋白酶与分子内部的酶切位点更易发生作用，促进酶解[15]；之后水解度逐渐趋于平缓，2.5～3 h达到平台期，原因可能是在90 min以后，可用于水解的肽键浓度降低，同时蛋白酶的活性随时间逐渐降低，最终APP、FPP和TP的水解度为28.55%、10.36%和15.58%，与张佳婵等[16]在其最佳实验条件下的水解度结果(19.61%±0.12%)、马小燕等[17]使用风味蛋白酶酶解的水解度(19.11%)较为相似，和徐阳等[18]的水解度(27.96%±0.5%)较为接近。

图1 大鲵肉酶解肽的水解度曲线

2.2 分子量分布分析结果

本课题组测定了酶解产物分子量分布信息，结果见表1。从表中可看出，该物质分子量分布主要集中在0～0.5 kDa、0.5～1 kDa和1～2 kDa3个范围，其中2 kDa以下分别为98.85%、93.36%和98.22%，与王文莉等[19]研究结果相似，符合已报道的食源生物活性肽的分子量范围特征。

表1 天然肽及酶解肽的分子量分布

2.3 酶解肽的抗氧化性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

酶解肽对DPPH自由基的清除作用如图2所示。从图中可看出，在实验设置的质量浓度范围内酶解肽对DPPH自由基均有一定的清除作用，能力与质量浓度成正比。当浓度在10 mg/mL时，APP、FPP、TP对DPPH自由基的清除率为60.65%±3.15%、65.01%±3.16%和59.06%±0.29%，其IC50值分别为5.92、3.54、5.43 mg/mL，FPP最高，3种酶在10 mg/mL时的DPPH自由基清除能力均高于天然肽的清除率44.81%±0.99%。而VC的清除能力较强，在浓度为1 mg/mL时清除率已超过90%。

图2 酶解肽及VC对DPPH自由基的清除率 图3 酶解肽及VC对超氧自由基的清除率

2.3.3 亚铁离子螯合能力

大鲵肉酶解肽的亚铁离子螯合能力如图4所示。从图中可看出，在实验设置的质量浓度范围内大鲵肉酶解肽有一定的亚铁离子螯合能力，其能力与质量浓度成正比。当浓度在2 mg/mL时，APP、FPP和TP的亚铁离子螯合能力为74.29%±0.11%、74.11%±0.42%和64.52%±0.41%，其IC50值分别为1.06、1.14、1.39 mg/mL，APP最高，且3种酶在2 mg/mL时的亚铁离子螯合能力均高于天然肽的清除率49.78%±1.99%。同时EDTA-2Na的亚铁离子螯合能力较强，在2 mg/mL时可达到90.87%。

2.4 细胞免疫活性

本课题组用MTT法测定了不同浓度肽对RAW264.7细胞增殖的影响。RAW264.7细胞处理48 h后，与未经样品处理的RAW264.7细胞相比，随着浓度的增长，细胞的增殖率逐渐升高，大鲵肉天然肽对细胞增殖率为20.52%，APP、FPP、TP的细胞增殖率最高为17.96%±0.49%、35.97%±1.56%和16.58%±0.78%，由图5可以看出，与另两种相比，FPP对RAW264.7细胞的增殖率在所有浓度下最高，同时，APP和TP对RAW264.7细胞的增殖率小于NP对细胞的增殖率，可能是因为这两种酶对大鲵本身含有的免疫物质造成了破坏，FPP的免疫活性最高。

图4 酶解肽及EDTA-2Na的亚铁离子螯合能力 图5 不同浓度酶解肽对RAW264.7细胞增殖率的影响

3 结 论

以大鲵肉经碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶酶解，水解度依次为28.55%、10.36%和15.58%。3种酶解肽分子量分布97%以上集中在5 kDa以下，其中2 kDa以下占98.85%、93.36%和98.22%，更加有利于吸收。

3种酶解肽对DPPH自由基、超氧阴离子清除能力和亚铁离子螯合能力均高于大鲵肉天然肽。3种酶解肽均有对RAW264.7巨噬细胞增殖活性，浓度为400 μg/mL时，细胞增殖率为17.96%±0.49%、35.97%±1.56%和16.58%±0.78%。综合比较，风味蛋白酶酶解肽的抗氧化和免疫活性均高于其它酶解肽，并高于大鲵肉天然肽的抗氧化和免疫活性，可广泛用于保健食品和化妆品。