微藻超低温保存条件的优化研究

卢杰 闫洪波 范利伟

摘   要：试验以小球藻为材料，探讨不同处理条件对超低温冷冻后成活效果的影响，以获得最优保存方法，重点针对微藻时期、预处理中的蔗糖浓度、玻璃化液中DMSO的浓度等方面的影响展开试验。结果表明，小球藻群体密度中等（OD680为0.800～1.100）的小球藻，0.5 mol/L甘油和0.4 mo1/L蔗糖的预处理液，30%蔗糖+15%乙二醇+5%二甲基亚砜+BG-11液体培养基的玻璃化液处理可以达到最高成活率，从而确定了小球藻的最适超低温保存条件。

关键词：微藻;超低温保存;玻璃化液;研究

常用的藻种保藏方法多为在液体培养基中进行继代培养，但此方法具有易污染、保藏时间短、操作烦琐费力和工作量大等缺点，而且多次传代培养还易造成藻种退化。自从英国科学家C.Polge等学者在1949年首次用甘油作冷冻保护剂，并用超低温冷冻保存的方法将动物精子保存成功后，超低温冷冻保存方法开始广泛应用于动、植物的种质保存[1]。由于超低温冷冻保存法具有快捷、细胞成活率高并且所需设备简便、投资少等特点， 目前已在部分动物和高等植物中进行了深入研究，针对国内藻类的超低温冷冻保存的报道较少，试验以来源于石家庄辛集的微藻（Chlorella sorokiniana）为材料研究冷冻保存中的关键因素，建立了与之相适应的超低温保存体系。

1   材料与方法

1.1   材料

微藻藻种Chlorella sorokiniana（Shihira & R.W.Krauss）来源于石家庄市废水。

1.2   微藻超低温保存处理方法

（1）在温度为25 ℃、光照强度为4 000 lx的培养箱中使用BG-11培养基在三角瓶中进行微藻培养，每天定时摇动，保证微藻正常生长。

（2）通过用分光光度计连续测定微藻溶液的吸光度来确定微藻的生长程度，选取不同生长程度的微藻进行同样的超低温处理，研究微藻生长状态对超低温处理效果的影响。

（3）用12 000转离心后收集微藻细胞，微藻细胞用含有0.5 mol/L甘油和不同浓度蔗糖的预处理液，于室温下处理微藻20 min。

（4）预处理后离心收集微藻细胞，置于4 ℃冰箱中预冷的含有不同DMSO浓度的玻璃化液（30%蔗糖+15%乙二醇+不同浓度DMSO+BG-11液体培养液），并进行脱水处理，1 h后在冰上更换新鲜的预冷玻璃化液，然后用纱布把EP管包住、用棉绳缠住快速放入液氮中，处理时间为90 min。

⑸液氮冷冻处理结束后，采取40 ℃恒温水浴快速解冻法解冻。离心收集微藻细胞后，先加入0.4 mo1/L的蔗糖溶液在室温平衡5 min，洗涤，弃上清，接着再加入1.2 mo1/L的蔗糖溶液于室温平衡5 min[2]，进行第2次洗涤，最后转入BG-11液体培养基进行光照培养，培养5 d后测定成活率。

⑹参照 Canavat及Lubian[3]方法，用分光光度计于波680 nm处测藻液的吸光度，与之对照的百分比值即为经过超低温冷冻保存后的藻细胞成活率[4]。

上述试验重复3次，每次试验设置3个平行样品，最终取其平均值。

2   结果与分析

2.1   不同生长时期的微藻对成活率的影响

由表1得知不同生长时期的微藻对成活率的影响为：随着微藻细胞浓度增大，冷冻处理后其成活率呈现先增大后减小的趋势。当680 nm吸光度值从0.649升高到0.982之间，成活率逐渐升高，并且在0.879～0.982之时成活率相差不是很大，达到了55%以上，但是在细胞浓度进一步升高超过0.982之后其成活率逐渐降低，成活率最低仅有19.33%。王起华等人认为抗冻性和藻类细胞年龄对成活率的影响与藻类种类有关[5]，试验结果进一步验证了这一个判断。Piasecki等人在[6]研究细胞密度对衣藻冷冻成活率的影响时得到的成活率趋势跟本试验完全一致。相对来说选择OD680在0.800～1.100时成活率较高。

2.2   预处理液中不同蔗糖浓度对成活率的影响

如图1所示，没有经过高糖培养基预处理的藻细胞成活率较低，仅为32.37%，随着蔗糖浓度的升高成活率逐渐升高，蔗糖浓度在0.4 mol/L时成活率最高。蔗糖浓度在0.5 mol/L以上时，随着蔗糖浓度的升高微藻成活率呈现出显著下降的趋势，当蔗糖浓度达到0.9 mol/ L时，成活率仅19.14% ，这是由于过高的蔗糖浓度形成渗透胁迫对藻细胞造成伤害，导致藻细胞受损，影响其成活率，因此以0.5 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的组合最佳，成活率可达到58.35%。在冷冻前对材料进行预处理能增强细胞的抗凍能力，常用的预处理液主要包括高浓度的蔗糖，有些研究中还在高浓度的蔗糖中加入甘油等其他保护剂[7，8]。与试验结果一致，表明合适的蔗糖浓度可以提高成活率。

2.3   玻璃化液中不同DMSO浓度对成活率的影响

B.J.Finkle等认为，DMSO、甘油、PEG是超低温保存植物材料的常用保护剂，且三者混合使用效果更好[9]。但是防冻剂本身对微藻也有一定的毒性，随着浓度的变化，毒性效果和保护效果也会有所变化。闫立强等[10]发现，DMSO对两种蓝藻的毒性与DMSO浓度有关。试验结果如表2所示，5%二甲基亚砜处理的微藻成活率最高。由此得知，高浓度的DMSO对微藻的毒害作用很大，但是低浓度的DMSO可以作为微藻的超低温冷冻保护剂，同时低浓度的玻璃化液起到了一定的保护作用，而且对藻的毒性也小。

综上所述，小球藻的生长时期、预处理液中不同的蔗糖浓度，以及玻璃化液中不同DMSO浓度都对小球藻的超低温冷冻成活率有着明显的影响。选用藻时，既要求达到一定的密度，也要求其生长活性较好，当680 nm吸光值为0.854时，用含有0.5 mol/L甘油和0.4 mo1/L蔗糖的预处理液，及30%蔗糖+15%乙二醇+5%二甲基亚砜+BG-11液体培养基的玻璃化液连续处理后，其超低温处理效果最好，从而确定这个条件是最好的小球藻超低温保存条件。