一株半滑舌鳎致病性假交替单胞菌的分离鉴定与药敏特性分析

鲍玉杰 尚玉曼 王恒

摘要 从患皮肤溃疡病的半滑舌鳎肝脏中分离到一株优势菌株CSLG2，根据细菌形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列鉴定及系统发育进化树分析结果，发现该菌株与假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）同源性最高。对该菌株进行药敏试验，结果发现该菌对米诺环素、红霉素、头孢他啶、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等药物高度敏感，而对红霉素、四环素、头孢唑啉、头孢拉定、青霉素和呋喃妥因具有一定的耐药性。

关键词 半滑舌鳎;假交替单胞菌;16S rDNA;药敏特性

Abstract A dominant strain CSLG2 was isolated from the liver of Cynoglossus semilaevis Günther with skin ulcer disease.According to the results of bacterial morphology observation，physiological and biochemical identification，16S rDNA sequence identification and phylogenetic tree analysis，the results showed that this strain had the highest homology with Pseudoalteromonas.The drug sensitivity test results of this strain showed that the bacteria was highly sensitive to minocycline，erythromycin，ceftazidime，ceftriaxone，chloramphenicol，norfloxacin，ofloxacin，and ciprofloxacin.However，it had certain resistance to erythromycin，tetracycline，cefazolin，ceftriaxone，penicillin and nitrofurantoin.

Key words Cynoglossus semilaevis Günther;Pseudoalteromonas;16S rDNA;Drug sensitivity

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther） 是一种温水性近海大型底层鱼类，隶属鲽形目（Pleuronectiforme）舌鳎科（Cnoglossidae）舌鳎属（Cynoglosus），由于其活动范围小、营养等级低、个体大、生长快，目前已成为我国沿海地区海水养殖鱼类的优良品种之一[1-2]。但是，随着产业规模的不断扩大，近年来养殖半滑舌鳎陆续发生各种疾病，临床常见体表溃疡病、烂尾病、腹水症等[3-5]。目前鳎類疾病主要有细菌性疾病、寄生虫性疾病、病毒性疾病3种类型，其中报道最多的是细菌性疾病，其主要病原有哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、河口弧菌（V.aestuarianu）、鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）、海水屈挠杆菌（Tenacibaculum maritimum）、鳎屈挠杆菌（T.soleae）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）等[6]。为进一步研究养殖半滑舌鳎溃疡病的病原及其发病机制，笔者对患病半滑舌鳎进行了病原菌筛取，主要从患病半滑舌鳎的体表、肾脏、脾脏、鳃、肠等部位分离出病原菌，经过形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析及系统发育学分析鉴定出一株假交替单胞菌，编号为CSLG2，并对其进行了药敏试验，旨在进一步探究其致病机制并为半滑舌鳎溃疡病的防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株。菌株CSLG2分离自天津市某养殖场中养殖的患溃疡病的半滑舌鳎肝脏。

1.1.2 试剂。2216E琼脂、TSB培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司;2×Taq PCR Master Mix酶、DNA Marker 购自博迈德生物有限公司;生化鉴定管、生物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3 仪器。超净工作台（SW-CJ-1FD，江苏通净净化设备有限公司）;高压灭菌锅（SX-500，江阴滨江医疗有限公司）;离心机（Centrifuge 5415R Eppendorf）;PCR仪（BIO-BAO）;恒温培养箱（SPX-105B-D，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;pH计（METTER TOLEDO，北京六一仪器厂）;数显恒温水浴锅（HH-3A型，金坛市金南仪器制造有限公司）;电泳仪（DYY-6C型，北京六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化。在无菌条件下，用接种环蘸取患病半滑舌鳎的皮肤溃烂处、肝脏、脾脏、肾脏、肠道等，并在2216E琼脂、TSB等固体培养基上划线，置于28 ℃恒温箱中培养24 h。挑取形态特征一致的优势单菌落，再次接种到2216E固体培养基上进行分离纯化，连续分离、纯化3次后，挑取优势单菌落置于灭菌的2216E液体培养基中，28 ℃恒温培养24 h，将获得的纯化菌株加入20%的甘油保种，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2 形态结构观察。首先在载玻片中央滴1滴水，用接种环挑取少量单菌落在载玻片上涂片固定，然后进行革兰氏染色，在油镜下观察细菌形态。

1.2.3 生理生化鉴定。将纯化得到的CSLG2菌株在2216E固体培养基上划线，28 ℃培养24 h后，使用无菌牙签挑取单菌落接种于细菌生化鉴定管中，并滴加1滴液体石蜡油，置于35 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察其颜色变化。参照《伯杰氏鉴定细菌学手册》和《伯杰氏分类细菌学手册》[7]，确定其生理生化特性。

1.2.4 16S rDNA检测鉴定与系统发育分析。

1.2.4.1 16S rDNA的PCR扩增。从患病半滑舌鳎肝脏处分离到优势菌株CSLG2，将纯化得到的CSLG2菌株接种在2216E液体培养基中，28 ℃、220 r/min恒温摇床中培养16 h后，取200 μL菌液在100 ℃沸水中煮10 min，然后1 200 r/min 离心10 min，上清即为DNA。以此DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：模板DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 6.25 μL、无菌水4.25 μL。PCR反应条件如下：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、72 ℃终延伸5 min。其中，PCR所用引物为细菌16S rDNA通用引物，正向引物为27 F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG），反向引物为1492 R（GGTTACCTTGTTACGACTT），引物由六合华大基因合成。

1.2.4.2 PCR产物的检测及序列分析。取2 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余送交上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果通过NCBI网站的BLAST检索系统进行同源系列比对分析，从中选取高度相似的序列，使用MEGA 6（molecular evolutionary genetic analysis，MEGA）软件构建16S rDNA的系统发育进化树。

1.2.5 药物敏感性测定。采用K-B纸片琼脂扩散法进行药敏试验[8]，取纯化菌株CSLG2接种于2216E液体培养基中，于28 ℃恒温培养箱中培养16 h后，进行梯度稀释，采用平板计数方法配制1.0×108 CFU/mL的菌液，吸取100 μL涂布在2216 E固体培养基平板上。然后，用无菌镊子将抗生素纸片轻轻贴在培养基表面，28 ℃恒温培养24 h后，测定抑菌圈直径，结果判定标准分为敏感（S）、中敏（I）、耐药（R）。

2 结果与分析

2.1 临床症状

患病的半滑舌鳎前期体表掉鳞，随着病情的加重，体表肌肉溃烂，溃疡面积不断增大;腹部肿胀，严重的有脱肛现象，经解剖后腹腔中有大量腹水，严重时可致死（图1）。

2.2 细菌形态学特征

菌株CSLG2在2216E瓊脂培养基平板上划线得到单菌落，菌落呈圆形，表面光滑湿润、有光泽，中央凸起，呈淡黄色，不透明，边缘整齐（图2）。革兰氏染色结果显示，菌株CSLG2为短杆状，呈红色，说明该菌株为革兰氏阴性菌（图3）。

2.3 生理生化特征

从细菌生化鉴定管的结果来看，CSLG2菌株对麦芽糖、N-乙酰葡糖胺的反应均呈阳性，并能利用葡萄糖，不能利用蔗糖，与侧金盏花醇反应呈阴性，其余反应也均呈阴性（表1）。将生化管的鉴定结果结合《伯杰氏鉴定细菌学手册》，其鉴定结果与假交替单胞菌最为相似。

2.4 16S rDNA序列分析及系统发育进化树分析

以CSLG2菌株全DNA为模板，以通用引物27F 和 1492R 扩增得到CSLG2菌株16S rDNA，通过琼脂糖凝胶电泳得到一条1 500 bp 左右的条带，条带清晰且单一（图4）。其余PCR产物经测序得到CSLG2菌株16S rDNA的序列大小为1 646 bp。将测序得到的拼接序列在NCBI网站上进行BLAST比对，发现菌株CSLG2与假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.IG23 ，序列号KU213138.1）同源性高达99%，由此可初步判定CSLG2菌株为假交替单胞菌属。将CSLG2 16S rDNA序列与其同源性较高的序列进行系统发育进化树分析，结果显示其与Pseudoalteromonas sp.IMCC17052聚为一支，与Pseudoalteromonas sp.IG23同源性也较高（图5），进一步说明菌株CSLG2菌株为假交替单胞菌。

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果表明，CSLG2菌株对红霉素、四环素、头孢唑啉、头孢拉定、青霉素、呋喃妥因均有耐药性，对链霉素、磺胺异噁唑表现为中度敏感，而其他26种药物均具有一定的抑菌效果，其中米诺环素、红霉素、头孢他啶、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等具有较强的抑菌能力（表2）。

3 讨论与结论

假交替单胞菌属是 Gauthier 等[9]根据细菌16S rDNA 序列对交替单胞菌属（Alteromonas）、希瓦氏菌属（Shewanella）、弧菌属（Vibrio）以及假单胞菌属（Pseudomonas）等若干菌株进行系统发育分析发现的区别于假单胞菌属（ Pseudomonas） 和交替单胞菌属（Alteromonas）的一个新属。该菌广泛分布于海洋环境中，是一类条件致病菌，能产生胞外毒素、胞外多糖、胞外酶以及病毒活性物质等与致病相关的多种物质[10]。研究表明，假交替单胞菌可感染海水养殖藻类和养殖动物等，可引起藻类（如绿斑、黄斑[11-12]等）和养殖动物体表溃烂[13]等疾病。假交替单胞菌是引起海带（Laminaria）孢子体红点病[14]和孔烂症[15]的病原菌，假交替单胞菌还可引起刺参（Apostichopus japonicus）腐皮病[16]、溃疡病[17]等。Pujalte 等[18]从患病的海鲈体内分离到1株假交替单胞菌，并发现其在养殖环境恶化时引起金头鲷和海鲈患病。乔迁等[19]从皮肤溃烂的七带石斑鱼（Epinephelus septemfasciatus）中分离出一株假交替单胞菌，并发现其可引起剑尾鱼鳞片脱落、体表溃烂至死亡。白雪松等[10]从群体死亡日本对虾（Penaeus japonicus）蚤状幼体中分离到 1 株致病菌，经鉴定为假交替单胞菌，并通过回复感染证实其对蚤状幼体和仔虾具有致死性。

该研究从患病的半滑舌鳎肝脏处分离到一株优势菌株CSLG2，根据菌落形态、细菌革兰氏染色特征、生理生化鉴定、16S rDNA序列鉴定和系统发育学分析结果鉴定该菌株为假交替单胞菌。根据药敏试验结果，初步鉴定出CSLG2菌株对红霉素、四环素、头孢唑啉、头孢拉定、青霉素、呋喃妥因有耐药性，而米诺环素、红霉素、头孢他啶、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等具有较强的抑菌能力，该研究结果有助于探讨鱼类疾病病原，并为防治该菌引起的半滑舌鳎及其他水生动物疾病提供参考。

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