3种不同倍性黑麦类作物种子形态比较和叶表皮显微观察

姚 锐， 高 慧， 郭世阳， 郭振清， 付金锋， 林小虎

(河北科技师范学院农学与生物科技学院， 河北 秦皇岛 066004)

黑麦是小麦的近缘植物，具有普通小麦所欠缺的抗病虫性(锈病、白粉病、蚜虫等)、抗逆性(耐寒、耐盐碱、耐旱、耐贫瘠等)、抗倒伏、分蘖力强等优良性状[1]。在小麦育种中，黑麦作为改良小麦遗传组成重要的基因库，受到小麦遗传育种研究者的广泛关注，许多有益基因已向小麦中转移并培育出新的种质资源[2]。小黑麦的培育是由小麦属和黑麦属物种通过远缘杂交、回交和组织培养的方法来获得的异附加系、异代换系、异易位系，是黑麦中的有益基因向小麦转移的桥梁，在生产上有直接利用价值的是六倍体小黑麦和八倍体小黑麦[3]。

目前，小黑麦的研究大都局限于种质资源培育，鲜见从种子形态和叶表皮结构角度鉴别不同黑麦类作物种质资源的报道。很多植物由于亲缘关系很近，看上去相似，但可能是不一样的种类[4]。扫描电镜作为一种可以得到试样微观形貌结构的仪器，在植物形态学分析方面得到了广泛应用。林婷婷等[5]对瘤足蕨科及其近缘植物叶表皮微形态进行了观察和比较，探讨了其分类学意义。Lubna[6]和Syed Nasar Shah[7]利用光学显微镜和扫描电镜对植物叶片表皮进行显微形态学研究，认为不同属间、不同种间叶片微形态的差异对植物分类和鉴定具有重要意义。王聪等[8]对大麦表皮蜡质的晶体结构进行分析，扫描电镜结果表明，叶片表皮蜡质晶体结构均为片状，而叶鞘和穗下茎表皮晶体蜡质结构均为棒状。因此，本研究从种子形态、叶表皮结构角度对黑麦类作物进行分析，旨在为黑麦类作物的分类和鉴定提供微观形态学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

本次研究所用实验材料二倍体黑麦(山农SC 1556)为荆州黑麦；六倍体小黑麦(山农HT 1638)由山东农业大学自墨西哥玉米小麦改良中心引进并经过多年种植、株系选择；八倍体小黑麦(山农OT 0202)由南京农业大学亓增军教授以荆州黑麦和普通小麦辉县红经远缘杂交获得，山东农业大学引进并经过株系选择。上述材料均由山东农业大学农学院国家小麦改良中心泰安分中心王洪刚教授课题组提供，种植于河北科技师范学院农学与生物科技学院试验农场。

1.2 方 法

1.2.1细胞学鉴定

将3种黑麦类作物种子置于盛有蒸馏水的培养皿中室温浸种待根长至1～2 cm时，剪取根尖放入EP管中，冰水浴36 h。用卡诺固定液(V乙醇∶V冰醋酸=3∶1)4 ℃固定2 d。

注：A为二倍体黑麦(2 n=14)，B为六倍体小黑麦(2 n=42)，C为八倍体小黑麦(2 n=56)；标尺为20 μm。图2 不同倍性黑麦类作物有丝分裂染色体数目

取已固定的根尖移置于1 mol·L-1HCl溶液中60 ℃解离6 min，蒸馏水漂洗10 min，取出放置在载玻片上，用刀片将根尖前端2～3 mm(顶端分生组织)切下，滴加1滴改良卡宝品红染液染色2 min，盖上盖玻片，用镊子尖端重复轻敲盖玻片，直至细胞分散。最后用滤纸吸去多余的染液。在显微镜(OLYMPUS BX 53)下观察细胞的分裂相、 染色体计数并采集图像。

1.2.2种子形态观察

对3种黑麦类作物种子均随机选择30粒，简单清洁除去表面灰尘后，置于体视显微镜(OLYMPUS SZX 16)下观察种子形态、测量大小并拍照。

1.2.3叶片扫描电镜观察

2018年9月下旬将3种参试材料于试验农场进行盆栽播种，待3种材料长至3叶期时取材，将叶片剪成小块，用杂交镊依次摆放于粘有导电胶带的扫描电镜载物台上，放置于场发射扫描式电子显微镜(日立SU 8010，工作电压10 kV)下观察叶表皮结构并拍照[5]。

2 结果与分析

2.1 不同倍性黑麦类作物有丝分裂染色体计数

采用改良卡宝品红压片法对供试材料根尖细胞染色体数目进行分析。3种材料均统计50个细胞。其中，二倍体黑麦中有47个细胞染色体数目为14，2个细胞染色体数目为13，1个细胞染色体数目为12；六倍体小黑麦中有45个细胞染色体目为42，3个细胞染色体数目为41，2个细胞染色体数目为40；八倍体小黑麦中有45个细胞染色体数目为56，2个细胞染色体数目为55，3个细胞染色体数目为54(图1)。依据李懋学等[9]制定的确定植物染色体数目的标准85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数，即可认为是该植物的染色体数目，确定本实验3种供试材料——黑麦(山农SC 1556)、六倍体小黑麦(山农HT 1638)、八倍体小黑麦(山农OT 0202)染色体数目分别为14、42和56(图2)。

图1 3种不同倍性黑麦类作物染色体数目计数

2.2 不同倍性黑麦类作物种子形态

利用体视显微镜对3种黑麦类作物的种子分别进行拍照观察并测量其大小。发现3种黑麦类作物种子颜色均为浅黄褐色；黑麦种子较为狭长，呈梭形(图3 A)，种子种皮遍布致密的无规则凸起带(图3 D)；六倍体小黑麦种子呈规则的长棒状，种子尾部有绒毛(图3 B)，种皮同样遍布致密的无规则凸起带(图3 E)；八倍体小黑麦种子呈规则的短棒状，种子尾部有绒毛(图3 C)，种皮两端较为皱缩，中部较为光滑(图3 F)。3种黑麦类作物种子大小有明显的不同：二倍体黑麦种子长度平均为8.2 mm，宽度平均为2.5 mm；六倍体小黑麦种子长度平均为8.3 mm，宽度平均为3.0 mm；八倍体小黑麦种子长度平均为6.0 mm，宽度平均为2.8 mm(表1)。在种子长度方面，二倍体黑麦和八倍体小黑麦之间、六倍体小黑麦和八倍体小黑麦之间存在极显著差异；在种子宽度方面，二倍体黑麦和六倍体小黑麦之间、二倍体黑麦和八倍体小黑麦之间、六倍体小黑麦和八倍体小黑麦之间均存在极显著差异(图4)。

注：A、D为二倍体黑麦，B、E为六倍体小黑麦，C、F为八倍体小黑麦；A、B、C标尺为1 mm，D标尺为200 μm，E、F标尺为500 μm。图3 不同倍性黑麦类作物种子形态

注：A为种子长度差异性比较；B为种子宽度差异性比较。图4 不同倍性黑麦类作物种子大小比较

表1 不同倍性黑麦类作物种子数据

材料倍性种子长度/μm种子宽度/μm二倍体黑麦2n=2x=148220.46752466.4640六倍体小黑麦2n=6x=428292.49272964.2077八倍体小黑麦2n=8x=565941.53132752.5390

2.3 不同倍性黑麦类作物叶表皮超微结构观察

对3种黑麦类作物叶表皮进行观察，发现3种作物叶片表皮细胞均呈长条状紧密排列，长轴与叶脉平行，气孔器均略微下陷，均有弥漫分布的表皮毛(图5 A,B,C)。 黑麦气孔器外拱盖呈脊状凸起(图5 D)，六倍体小黑麦、八倍体小黑麦气孔器外拱盖或呈脊状突起或呈凹陷状，三者气孔器均呈椭圆形(图5 E,F)。3种黑麦类作物叶片气孔器大小有明显的不同：二倍体黑麦气孔器长度平均为43μm，宽度平均为21μm；六倍体小黑麦叶片气孔器长度平均为62μm，宽度平均为21μm；八倍体小黑麦叶片气孔器长度平均为78μm，宽度平均为26μm(表2)。在叶片气孔器长度方面，二倍体黑麦和六倍体小黑麦之间、二倍体黑麦和八倍体小黑麦之间、六倍体小黑麦和八倍体小黑麦之间均存在极显著差异；在叶片气孔器宽度方面，二倍体黑麦和八倍体小黑麦之间存在显著差异(图6)。

表2 不同倍性黑麦类作物叶片气孔器数据

材料倍性气孔器长度/μm气孔器宽度/μm二倍体黑麦2n=2x=1443.14020.980六倍体小黑麦2n=6x=4262.26021.380八倍体小黑麦2n=8x=5677.97025.710

注：A、D为二倍体黑麦；B、E为六倍体小黑麦；C、F为八倍体小黑麦；A、B、C比例尺为100 μm;D、E、F比例尺为800 μm图5 不同倍性黑麦类作物叶表皮形态特征

注：A为气孔器长度差异性比较；B为气孔器宽度差异性比较。图6 不同倍性黑麦类作物叶片气孔器大小比较

3 讨 论

本实验对3种黑麦类作物进行根尖染色体计数，存在少部分细胞染色体数目与理论值不符的情况，可能是因为制片时人为因素导致染色体丢失或者染色体恰好重叠未分散开。利用体视镜对3种黑麦类的种子进行形态学观察，发现种子大小存在显著性差异，种子外形和种皮形貌存在明显的不同。其中黑麦种子呈梭形，较为狭长，种皮遍布致密的无规则凸起带；六倍体小黑麦相对黑麦而言较宽，种皮同样遍布致密的无规则凸起带；八倍体小黑麦较小，两端的种皮较为皱缩，中部较为光滑；六倍体和八倍体小黑麦种子尾部有绒毛。利用扫描电镜对3种黑麦类作物的叶片进行观察，结果表明彼此表皮细胞结构没有明显差异，但气孔器有大小的显著性的差别：黑麦和六倍体小黑麦叶片气孔器的宽度相差不大，但六倍体小黑麦叶片气孔器比黑麦叶片气孔器长，八倍体小黑麦叶片气孔器比上述二者更大，其在长度上的数值接近黑麦叶片气孔器长度的一倍。由于所研究3种黑麦类作物种植环境相同，根据结果推测种子及叶片气孔器的差异由其物种遗传信息决定。王运涛、薛丹及刘培卫[7,10-12]对其他植物进行了研究，得出了不同品种乃至不同属间植物的种子形貌和叶表皮微结构可以鉴别植物物种的相似结论。表明不同倍性黑麦类作物种子形貌和叶片气孔器的差异可以作为不同倍性黑麦类作物间差异鉴定的依据之一。

植物表面微结构丰富的多态性可以作为种间鉴别的参考依据[6,13]，因此很可能对于整个小麦族作物而言，种子及叶片表面微结构可以反映不同物种麦类作物之间的差别。然而，由于本实验研究的麦类作物种类较少，要得出严谨的麦类作物与其形态学微结构差异的相关性结论，还需要对更多种的麦类作物进行全面的研究。