SSR 与SRAP 分子标记在烤后烟叶中的应用及烤烟遗传多样性分析

轩贝贝，胡利伟，田阳阳，过伟民，郭建华，刘 魁，王正旭，田栾栾，赵艳珍，孟祥宇，余 涵，张艳玲*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001 2. 红塔烟草（集团）有限责任公司，云南省玉溪市红塔大道118 号 653100

烟叶烘烤是烤烟生产中的一个重要环节。烘烤期间烟叶外观以及内部化学组成均发生了较大变化，除烟叶中的淀粉、蛋白质等大分子物质会随烘烤时间延长发生不同程度降解外［1-2］，烟叶基因组DNA 也会随烘烤进程而发生变化。目前国内外对烟叶在烘烤过程中基因组DNA 的变化情况研究较少。郭兆奎等［3］对适于PCR 分析的烤后烟叶DNA 提取方法进行了试验，认为高温烘烤条件下烟叶DNA 会发生严重降解，且对后续PCR 反应造成较大影响。在自然条件下，植物叶片离体后DNA 在核酸酶的作用下缓慢降解，而烘烤过程在一定程度上加快了烟叶DNA 的降解速率，研究发现影响叶片DNA 降解的因素很多，其中环境温度、湿度等为主要因素［4］。但烘烤过程中的烟叶DNA 降解程度如何，烤后烟叶DNA 能否继续用于分子标记等方面的研究还相对较少。

随着分子生物技术的发展与应用，分子标记的优势逐渐凸显，因其兼具稳定准确、干扰因素少、检测手段便捷等优点已成为应用率较高的技术之一［5-6］。在植物遗传多样性研究中常用的分子标记多以PCR 反应为基础，主要有随机扩增多态 性DNA 标 记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、相 关序列扩增多态性（Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP）、简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）等［7-10］。除此之外，还有一些新型分子标记，如单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）或插入缺失（InDels）、表达序列标签（Expressed Sequences Tags，EST）［11］等。这些分子标记各有所长，应用领域也有所不同。有研究发现SSR 标记比ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR）标记能更好地反映物种间基因遗传多样性［12］，SRAP 标记比AFLP 标记能更清楚地揭示植物形态学差异及进化史［13］。由于SRAP 与SSR 标记的优势明显，其在烤烟上的应用也非常广泛。聂琼等［14］对5 个烟草属134 个种质的研究表明，SRAP 标记具有较好的多态性，能很好反映烟草品种间的亲缘关系；邓力超等［15］利用SRAP标记对52 份普通栽培烟草进行分类鉴定，证实了SRAP 标记以新鲜烟叶为材料分析烤烟遗传多样性的高效性与有效性；Bindler 等［16］公布了1 张标记位点最多、密度最大的烟草高密度遗传图谱，为烟草分子标记提供大量的遗传信息。近年来的研究显示，SSR 标记在种质资源的鉴定与利用、基因定位等方面具有较好的应用前景［17-18］。黄莉莎等［19］利用SSR 标记构建了烟草主栽品种的遗传图谱，为烤烟遗传多样性分析提供了有效的SSR 引物；陈芳等［20］筛选出了8 对重复性好、多态性高的SSR 引物，可将32 份烟草种质资源分为4 个大类，充分显示了SSR 标记在烟草品种遗传多样性分析中有着良好的应用潜力。然而，以上分子标记在烟草上的应用多以苗期烟叶为研究材料，很少涉及烤后烟叶。随着研究技术的成熟及生产的需要，用烤后烟叶分析烤烟遗传多样性很有必要。由于烤后烟叶无论是形态特征还是生理生化特性均发生较大变化，对其进行烤烟遗传多样性分析必须寻找适用于烤后烟叶的分子标记。而目前SRAP 与SSR 分子标记在烟草上的应用较多，为此以烤后烟叶为研究对象，利用毛细管电泳检测技术分析了SRAP 与SSR 两种分子标记在烤后烟叶中的稳定性及多态性，以期筛选出适用于烤后烟叶的分子标记并用于烤烟品种遗传多样性分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟材料见表1。2018 年11 月在中国烟草总公司郑州烟草研究院温室中育苗，培养至60 d左右，每个品种取10 个单株叶片混合后作为试验样本。

采用三段式烘烤工艺进行烟叶调制。在烘烤过程中全程跟踪取样，每隔24 h 取样1 次，包括变黄阶段（烘烤0、24 和48 h）、定色阶段（烘烤72 和96 h）、干筋阶段（烘烤120、144 和168 h）等3 个阶段的8 个时间点。9 个烤烟品种的烤后烟叶样品除NC297 和云烟116 来自云南玉溪峨山产区外，其他7 个品种均来自云南玉溪世界烟草品种园。每个品种取样10 片，烟叶混合后作为试验样本。

表1 供试烤烟材料的来源Tab.1 Flue-cured tobacco cultivars used in this study

1.2 仪器与试剂

NanoDrop 2000 超微量分光光度计、超低温冰箱（美国Thermo Fisher 公司）；Milli-Q 超纯水处理仪（美国Millipore 公司）；微波炉（松下家电有限公司）；电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统、PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；移液器、高速离心机（德国Eppendorf 公司）；电子天平（精密度0.01 mg，德国赛多利斯科学仪器有限公司）；水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；3730XLDNA 序列分析仪（美国ABI 公司）。

Ezup 柱式植物基因组DNA 提取试剂盒、琼脂糖、TAE 缓冲液、SSR 和SRAP 引物等由生工生物工程（上海）有限公司提供；混合型聚合酶、dNTPs、6×DNA 上样缓冲液、λDNA/EcoRI+HindIII Marker 等均购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 烟叶基因组DNA 的提取与检测

根据Ezup 柱式植物基因组DNA 提取试剂盒说明书进行烟叶基因组DNA 的提取，烟叶中糖类、蛋白质、RNA 和酚类等物质的去除是DNA 提取成功的关键 。为满足后续PCR 的要求，提取DNA 时加入2% β-巯基乙醇，并用酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）重复抽提，以除去烟叶中的蛋白质等杂质，提高烟叶DNA 纯度。将每个品种的10 份试验样品混合并提取烟叶基因组DNA，重复提取3 次，最 后 溶 解 于50 μ L TE 缓 冲 液（含EDTA 的Tris-HCl，pH 8.0）中，用 超 微 量 分 光 光 度 计NanoDrop 2000 检测烟叶DNA 浓度与纯度，并将DNA 样品贮存于-20 ℃备用。

1.4 琼脂糖凝胶电泳

配制浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，取5 μL DNA溶液与1 μL 6×DNA 上样缓冲液充分混合，小心添加到加样孔中进行琼脂糖凝胶电泳。电压设为100 V，在室温下电泳45 min，将琼脂糖凝胶置于GelRed 染液中浸染45 min，然后在凝胶成像仪中观察并拍照记录电泳结果。

1.5 SRAP 与SSR 引物的合成

SRAP 与SSR 引物主要来源于文献查找，主要有Bindler 等［16］公开发表的SSR 引物，以及薛怀裕等［22］筛选的SRAP 引物。荧光引物是在正向引物的5'端随机标记FAM 或HEX 荧光，其中蓝色为FAM 荧光标记，绿色为HEX 荧光标记。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表2 和表3。

表2 SRAP 引物序列信息Tab.2 Sequences of SRAP primers

表3 SSR 引物序列信息Tab.3 Sequences of SSR primers

1.6 荧光引物PCR 扩增

配制25 μL PCR 扩增体系［23］：包括50 ng 模板DNA、2 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 mmol/L 正向和反向引物、10×PCR Buffer、1.0 U TaqDNA 聚合酶，其余用超纯水补足。

SSR-PCR扩增程序及参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循环10 次；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循环20 次；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，或置于-20 ℃保存备用。

SRAP-PCR扩增程序及参数：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s、35 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循环10 次；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循环30 次；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，或置于-20 ℃保存备用。

1.7 毛细管电泳检测

吸取990 μL HIDI 和10 μL LIZ500 的混合物，加入到96 孔反应板中；5 000 r/min 短暂离心，在标记好的96孔板孔中加入相应的PCR产物，5 000 r/min短暂离心；将96孔板用封板膜密封，再次5 000 r/min短暂离心。将96 孔板置于PCR 仪上。变性程序为：98 ℃变性5 min，完成后立即将96 孔板置于冰上迅速冷却，10 000 r/min 短暂离心。使用ABI3730XLDNA 序列分析仪进行毛细管电泳，检测PCR 扩增产物的片段大小。采用Genemapper 软件读取检测结果，以信号峰图形式输出。图谱中的每一个电泳峰代表PCR 扩增产物，根据电泳峰的位置和形状选择清晰且稳定的峰判断并记录DNA 片段长度，将峰图清晰稳定出现的标记为“1”，相同位置无峰的标记为“0”，建立“0”与“1”二元数据矩阵。利用NTSYS-2.10e 软件计算供试烤烟品种间的遗传相似系数，基于SHAN 算法进行UPGMA 聚类分析，并构建遗传聚类图［24］。

2 结果与分析

2.1 烟叶DNA 提取与检测

将提取的所有DNA 样品经超微量分光光度计检测浓度与纯度，烟叶DNA 浓度为115.6～150.8 ng/μL，OD260/280值在1.77～2.03 之间。说明提取的烟叶DNA 纯度较高，所采用的商售试剂盒能够较好地将烟叶中的蛋白质、酚类等物质除去，对提取过程中残留的乙醇、三氯甲烷等的去除效果也较好，提取的DNA 能满足分子标记筛选等后续试验要求。

2.2 烘烤过程中烟叶DNA 的降解

将不同烘烤时间段的烟叶基因组DNA，利用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果见图1。

烘烤过程中烟叶DNA 的琼脂糖凝胶电泳结果显示，随着烘烤时间的延长DNA 条带亮度整体呈减弱趋势，其中泳道1～6 的条带清晰且集中，大小约18 kb，弥散带亮度弱且短，从烘烤开始至烘烤的干筋前期烟叶DNA 并未发生明显降解；泳道7、8 的条带亮度明显减弱，弥散带相对增强，弥散带范围在3～18 kb 之间，表明DNA 发生了部分降解，可能原因为在干筋中后期烘烤温度大幅升高，高温条件下造成DNA 解链或断裂。

图1 不同烘烤时间段的烟叶DNA 电泳图谱Fig.1 DNA electrophoretogram of tobacco leaves cured for different time

2.3 烤后烟叶和新鲜烟叶的DNA 完整度比较

9 个烤烟品种的新鲜烟叶和烤后烟叶DNA 电泳检测结果（图2）显示，新鲜烟叶DNA 条带清晰、带型单一，烟叶DNA 较为完整，未发生明显降解现象；而烤后烟叶DNA 条带均呈现弥散状分布，其中泳道2（NC297）、14（云烟116）及18（云烟87）的弥散范围较小，约在1～18 kb 之间，泳道4（中烟100）、6（翠碧1 号）、8（K326）、10（KRK26）、12（云烟97）、16（红花大金元）的弥散范围相对较长，从18 kb 延续到0.5 kb 以下。总体上看，烤后烟叶DNA 均发生严重降解，但不同品种降解程度略有不同。

图2 不同品种新鲜烟叶与烤后烟叶的DNA 电泳图谱Fig.2 DNA electropherogram of fresh and cured tobacco leaves from different cultivars

2.4 SRAP 与SSR 引物PCR 扩增稳定性比较

以9 个烤烟品种的烤后烟叶DNA 为模板，利用荧光标记的SRAP 引物和SSR 引物进行PCR 扩增，经毛细管电泳检测两种分子标记在9 个烤烟品种中的扩增结果，见图3 和图4。

SRAP 引物PCR 扩增结果（图3）显示，引物SRAP5 虽然在NC297 和云烟87 两个品种中扩增产物相对稳定且扩增产物约为110 bp，但在其他7个烤烟品种的3 次重复中扩增产物的数量及片段长度均存在差异；引物SRAP7 除NC297 扩增结果较稳定外，其他8 个烤烟品种的3 次生物学重复中常出现或长或短的非目的片段；引物SRAP16 在9个烤烟品种中扩增结果较稳定的有NC297、中烟100 和翠碧1 号等，在其他6 个品种的3 次重复中出现不稳定存在的扩增产物。总体来看，SRAP标记在烤烟品种中均有良好的多态性，但在3 次生物学重复中表现不稳定，其结果可靠性偏低。

SSR 引物PCR 扩增结果（图4）显示，引物NTGS66292 在云烟87、云烟116 以及红花大金元等3 个烤烟品种中扩增产物片段大小均为136 bp，且3 次重复无明显差异，其余6 个烤烟品种中均为150 bp，总体稳定性较好；引物PT30403 在翠碧1号的3 次生物学重复中PCR 扩增产物均为245 bp，在其他8 个烤烟PCR 扩增产物均为230 bp，引物PT30361 在云烟116 和红花大金元两个烤烟品种中的PCR 扩增产物均为174 bp，在KRK26 的PCR扩增中同时出现174 bp 和186 bp 两种产物。3 对引物在9 个烤烟的3 次生物学重复中均保持良好的扩增稳定性，表明SSR 标记在烤后烟叶中也较为稳定，且重复性较好，结果可靠性高。

图3 SRAP 标记在烤后烟叶中的扩增稳定性Fig.3 Amplification stability of SRAP markers in cured tobacco leaves

图4 SSR 标记在烤后烟叶中的扩增稳定性Fig.4 Amplification stability of SSR markers in cured tobacco leaves

2.5 SSR 引物筛选与烤烟遗传多样性分析

鉴于SSR 标记较好的稳定性，以9 个烤烟品种的烤后烟叶DNA 为模板，从文献中筛选54 对SSR引物进行PCR，结合毛细管电泳检测技术，并优化PCR 条件，从54 对SSR 引物中筛选出8 对能够稳定扩增并在品种间有差异的引物，分别是NTGS66290、NTGS66292、NTGS66295、PT30008、PT30169、PT30361、PT30403 和PT30424。统计毛细管电泳检测结果，并绘制出8 对SSR 引物在供试品种中的0、1 矩阵，结果见表4。

表4 9 个烤烟品种的指纹图谱Tab.4 Fingerprints of 9 flue-cured tobacco cultivars

根据8 对SSR 引物在9 个烤烟品种中的PCR扩增结果绘制出烤烟指纹图谱（表4）可知，8 对SSR 引物在9 个烤烟品种中共检测到92 个扩增产物，其片段大小处于92～245 bp 之间，其中多态性条带20 个，多态性检出率为21.74%，8 对SSR 引物能够将9 个烤烟品种区分开，其中NTGS66290和PT30424 两对引物的多态性较好，PT30008和PT30403 分别是红花大金元、翠碧1 号的特征引物。

采用UPGMA 算法计算遗传9 个烤烟品种的遗传相似系数并绘制遗传聚类图，9 个烤烟品种间遗传相似系数分布在0.250～0.900 之间，平均值为0.622（表5）。由遗传相似系数获得的聚类图（图5）表明，当遗传相似系数为0.649 时，可将9 个烤烟品种分为4 个类群。其中云烟87、云烟116、K326、KRK26、中烟100 和NC297 聚为一类，而红花大金元、翠碧1 号及云烟97 与这一类的遗传距离较远。云烟87 与K326 首先聚在一起，说明两者遗传背景较近，遗传相似系数为0.900。遗传相似系数最小为0.250，出现在红花大金元和云烟97 两个品种间。由此可见，8 对SSR 引物可将9 个烤烟品种进行有效区分。

表5 9 个烤烟品种的遗传相似性分析Tab.5 Genetic similarity analysis of 9 flue-cured tobacco cultivars

图5 9 个烤烟品种的SSR 标记聚类图Fig.5 Dendrogram of 9 flue-cured tobacco cultivars based on SSR markers

3 讨论

本研究中通过提取新鲜烟叶、烘烤中烟叶、烤后烟叶基因组DNA，结果表明新鲜烟叶DNA 条带单一，其片段大小约18 kb，这与Xin 等［25］研究结果类似；在烘烤过程的中后期，烟叶DNA 出现一定程度降解，而烤后烟叶则出现大量降解，说明烟叶基因组DNA 的降解始于烘烤的干筋期。烤后烟叶DNA 之所以出现大量降解的原因可能是烟叶烘烤完成并移出烤房后的贮存环境相对湿度增大，加快了DNA 的降解速率，这与前人研究DNA的降解规律相符合［26-27］。

在引物多态性方面，SRAP 标记多态性较好，SSR 标记多态性一般，说明SRAP 标记的多态性略优于SSR 标记，这与玉米、马铃薯、草莓等作物中的研究结果基本一致［28-30］。而在稳定性方面，SRAP 标记在烤后烟叶中的稳定性远劣于SSR 标记，部分原因可能是SRAP 标记主要在ORF 特定区域进行特异扩增，位于功能性区域，其多态性条带较多，PCR 扩增结果不稳定［31］。有学者研究显示，与其他基于PCR 的分子标记相比，SSR 标记的优势体现在较好的重复性［32］，SSR 标记有更高的稳定性可能是因为SSR 标记长度一般较短，两侧序列也较为保守，且均匀分布于植物整个基因组中。孙九喆［33］等利用SSR 标记构建不同烤烟品种的指纹图谱，能够对初烤烟叶品种进行快速区分。另外有研究显示随着DNA 的降解，SSR 标记甚至比SNP 标记的效果更好［34］，基于SSR 标记在烤后烟叶中的重复性、可靠性以及特异性，在烤后烟叶的遗传多样性研究中将发挥重要作用。

栽培烟草（尤其是烤烟）由于经历长时间的人工驯化和定向选择导致遗传基础相对狭窄［35-36］，在本试验中也出现相同的结果。9 个烟草主栽品种的遗传相似系数在0.250～0.900 之间，如云烟116与云烟87、K326 与KRK26 间的遗传相似系数高达0.900。虽然品种间遗传相似性较高，但SSR 分子标记依然能够将其区分开来，说明基于烤后烟叶利用SSR 分子标记技术分析烤烟品种遗传多样性的策略可行。由于9 个主栽品种间亲缘关系较近，引物筛选难度较大，因此在筛选更多的鉴别能力强的引物，进而对品种进行更加快速有效地区分方面仍有待进一步深入研究。

4 结论

烘烤过程中烟叶DNA 在变黄期、定色期以及干筋期的前期并未发生明显降解，仅在干筋期的中、后期出现部分降解，而烤后烟叶DNA 的降解则非常严重。SRAP 与SSR 两种分子标记在烤后烟叶中的扩增稳定性与多态性方面，SRAP 标记的多态性略优于SSR 标记，而SSR 标记比SRAP 标记具有更好的重复性和稳定性。因此，针对烤后烟叶利用SSR 标记分析烤烟品种遗传多样性更为可靠。其中NTGS66290、NTGS66292、NTGS66295、PT30008、PT30169、PT30361、PT30403 和PT30424等8 对SSR 引物能将9 个烤烟品种进行有效区分，其遗传相似性系数为0.250～0.900，平均值为0.622。