海南短指软珊瑚全基因组测序初步分析

王沛政,李卫东

(海南热带海洋学院 生态环境学院,海南 三亚 572022)

0 引言

珊瑚生态系统是海洋中最大的生态系统,也是最复杂的水中生态系统,它在所有海洋生态系统中提供了最高的生物多样性[1-2].软珊瑚属于刺胞动物门(Cnidaria)、珊瑚虫纲(Anthozoa)、八放珊瑚亚纲(Octocorallia)软珊瑚目(Alcyonacea).软珊瑚科下的属有肉芝软珊瑚属(Sarcophyton)、豆荚软珊瑚属(Lobophytum)和短指软珊瑚属(Sinularia)等 18 个属.短指软珊瑚(Sinularia)全球种类有170多种,是拥有种类数量最多的软珊瑚属.其中,在印度洋-太平洋海域Sinularia有128种,个体形态变化很大,其群体直径从几厘米到几米不等,有些种类甚至成为一些珊瑚礁区域的优势种[3].软珊瑚在全球分布广泛,已经发现软珊瑚种类超过3 000 种,从近岸浅海珊瑚礁到深海,热带和亚热带到高纬度地区都有分布,而且在整个印度-西太平洋珊瑚礁海域软珊瑚的丰度和多样性都很高[4-5],不仅孵育了大量的海洋生物,而且为海洋生物提供栖息、生活和繁殖场所[6].SWEATMANET等[7]报道，大堡礁(GBR)多达37%的礁区被软珊瑚覆盖.在东沙环礁上，一些珊瑚礁60%～70%区域为软珊瑚所覆盖[8].软珊瑚肉质柔软而不被海洋中的其他动物所啃食,这可能是与其次生代谢产物有关.现已从软珊瑚中分离获得了一系列具有拒捕食、防附着、抗微生物等化学防御作用的化合物,而且软珊瑚中部分化合物也显示了较强的药理活性,如抗肿瘤、抗菌以及抗病毒等[9-13].

软珊瑚形态学鉴定比较困难.目前,一般是通过共肉组织中CaCO3骨针和外部形态2个形态特征来进行种类鉴定[14].经典生物分类学为部分软珊瑚分类提供了可靠的分类方法,但是大部分软珊瑚分类和系统发育关系仍然不明确,分类仍然相当混乱,分类上出现了许多同物异名现象[15].MCFADDEN等[16]认为，软珊瑚体内骨针形态丰富、多变,目前根据骨针形态分类存在一定困难,需要积累大量经验；对于不同的分类学家,骨针形态分析时具有强烈的主观性.软珊瑚的全基因组信息能为上述问题的解决提供新的思路.

软珊瑚在全球分布广泛,在珊瑚礁系统中发挥着重要作用.HUA等[17]于2019年首次报道了造礁石珊瑚多孔鹿角珊瑚(Acroporamillepora)的全基因组测序研究结果.目前,软珊瑚全基因组测序研究尚未见报道.笔者以海南岛周边地区主要的软珊瑚——短指软珊瑚为研究对象,通过高通量测序等技术手段初步对其进行了全基因组测序研究,旨在为本地区软珊瑚的保护和研究提供基础数据.

1材料与方法

1.1 材料

短指软珊瑚Sinulariaceramensis来源于海南三亚西岛海域.

1.2 短指软珊瑚共肉组织不同部位虫黄藻的分布鉴定方法

利用手术刀片取出短指软珊瑚共肉组织的表层组织和中部组织进行压片,然后用显微镜进行观测.

利用短指软珊瑚特异的COI引物和28s rDNA引物对短指软珊瑚共肉组织的表层组织和中部组织的DNA进行PCR扩增电泳检测,来确定能否扩增出短指软珊瑚共肉组织.利用虫黄藻特异性ITS引物进行PCR扩增电泳检测,来确定能否扩增出虫黄藻基因组DNA,进而确定虫黄藻在短指软珊瑚共肉组织分布情况.具体引物序列如下：

(1)ITS引物：上游引物为5′-CCGGTGAATTATTCGGACTGACGCAGTGCT-3′；下游引物为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.目标序列片段大小为750 bp.

(2)COl引物：上游引物为5′-CCATAACAGGACTAGCAGCATC-3′；下游引物为5′-ATCATAGCATAGAACCATACC-3′.目标序列片段大小为1 000 bp.

(3)28 s引物：上游引物为5′-GCACTTCTGGAGGGCGAGCCGT-3′；下游引物为5′-TTCCACTGGCTTCACCCTATTCA-3′.目标序列片段大小为450 bp.

1.3 软珊瑚全基因组测序

检测合格的DNA 样品通过 Covaris 超声波破碎仪随机打断成长度为 350 bp 的片段,末端修复、加 A 尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备.构建好的文库通过 Illumina Nova Seq进行 PE 测序.

2 结果与分析

2.1 短指软珊瑚共肉组织不同部位虫黄藻分布分析

光滑短指软珊瑚活体图像及其共肉组织见图1，图中粗壮的茎干白色箭头所示为短指软珊瑚的取样部位.

图1 短指软珊瑚图像及其共肉组织

短指软珊瑚共肉组织的表层组织和中部组织进行压片,显微镜检测如图2所示,左边图像为短指软珊瑚共肉组织的表皮部位组织压片,从图中可以观察到大量虫黄藻个体；右边图像为短指软珊瑚共肉组织的中间部位组织压片,图中有大量的骨针,但没有发现虫黄藻个体.因此，短指软珊瑚共肉组织中部可能没有虫黄藻.

图2 短指软珊瑚(Sinularia ceramensis Verseveldt )共肉组织不同部位压片

为进一步检测短指软珊瑚共肉组织表层组织和中部组织是否存在虫黄藻DNA,我们利用短指软珊瑚特异的COI引物和28s rDNA引物和虫黄藻特异性ITS引物对短指软珊瑚共肉组织不同部位组织DNA进行PCR扩增电泳检测(图3).点样孔2和3为软珊瑚共肉组织的中部组织和表层组织虫黄藻特异性ITS引物扩增结果,点样孔2未扩增出条带,表明中部组织没能扩增出虫黄藻特异性ITS条带,表明该部位没有虫黄藻DNA存在,点样孔3扩增出虫黄藻特异性ITS条带,表明表层部分存在虫黄藻DNA.点样孔4～7分别为短指软珊瑚特异Col和28s引物在中部组织和表层组织的扩增结果,从中均可以扩增出明亮清晰的DNA条带,证明短指软珊瑚共肉组织的中部组织和表层组织均能扩增出较好的珊瑚组织DNA.以上结果说明，短指软珊瑚共肉组织表皮部位有虫黄藻分布,中间部位没有虫黄藻分布.

注：1：Markers；2～3：ITS(虫黄藻)；4～5：Col(软珊瑚)；6～7：28S (软珊瑚).图3 短指软珊瑚共肉组织不同部位DNA扩增产物结果

2.2 短指软珊瑚测序数据统计

由于短指软珊瑚共肉组织中部部位没有有虫黄藻分布,我们利用其中部组织取样进行了全基因组测序.经过对测序数据的严格过滤,得到高质量的clean data.对产出数据进行统计(表1),GC 含量比例用于检测有无 AT和GC 偏分离现象.测序数据的质量的高低主要表现在 Q20的大小,这样才能保证后续高级分析的正常进行.从表1中可以看出，样品原始测序数据量为 36.89 G,测序质量正常(Q20≥90%,Q30≥85%),测序错误率正常(<0.05%).

表1 Sinularia ceramensis Verseveldt 测序数据产出统计

2.3 短指软珊瑚测序数据污染评估

取短指软珊瑚部分有效测序数据比对到NCBI核苷酸数据库(NT),结果见表2.选取比对结果中的前5个比对结果,均比对到Sinulariapeculiaris等序列,因此是同源比对,测序序列均为软珊瑚基因组序列,表明测序成功.虽然前5位是同源比对,但在比对结果的后面出现少量的菌类污染,其污染可能来自软珊瑚内部共生菌.

表2 测序数据污染比对结果统计

2.4 K-mer 分析估计基因组大小和杂合率

在基因组组装前,可以通过测序得到的序列估计基因组特征(表3),我们采用基于 K-mer 的分析方法来估计基因组大小和杂合率等.其中K-mer为17,短指软珊瑚修订全基因组大小约649 Mbp,其中杂合率为1.25,基因组碱基重复率约为57%.结果表明，软珊瑚基因组较小,有一定程度的杂合率,但基因组碱基重复率较高.杂合率和基因组碱基重复率高会给全基因组序列组装构成困难.

表3 基因组特征统计情况

2.5 组装结果数据统计

Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs,将所有的Contig长度相加,能获得1个Contig总长度.Contigs拼接组装获得一些不同长度的Scaffolds.将所有的Scaffold长度相加,能获得1个Scaffold总长度.统计结果见表4.采用 kmer=43 进行初步组装,得到 contig N50 为 836 bp,总长为 586.07 Mbp,Scaffold N50 为1 044 bp,总长为 599.11 Mbp.实验结果表明,光滑短指软珊瑚的基因组为1个复杂的基因组,需要采用相应的策略进行基因组组装.

表4 组装结果数据统计

3 讨论

珊瑚线粒体基因组的进化通常比相应的核基因组慢，MCFADDEN等[18]认为，线粒体DNA在八放珊瑚中作为DNA条形码具有一定的局限性,利用COI+igr1+msh1条形码对软珊瑚进行种类鉴定也不够完美.这就造成传统分类的许多形态特征与分子系统发育证据不一致,许多种类可能代表同一种.近期我们实验室通过msh1基因和COI基因分析结合形态学对肉芝软珊瑚进行种类鉴定,结果发现，msh1基因和COI基因对某些种仍然难以区分[20].因此，挖掘软珊瑚核基因组信息将有助于该问题的解决.

大部分软珊瑚都利用与虫黄藻共生获得自己所需要的营养物质.虽然虫黄藻利用其光合作用功能为珊瑚活体获取养分提供了帮助,但虫黄藻的存在为科学家在研究珊瑚分子水平机理时造成麻烦.尤其是在转录组和基因组水平研究珊瑚基因表达时很难排除虫黄藻基因表达的污染.HUA等[17]1376在对多孔鹿角珊瑚全基因组测序注释研究中,为了排除虫黄藻基因的污染,大量收集珊瑚单个个体精子及幼胚,该时期段的珊瑚组织不含虫黄藻.珊瑚一般1年繁殖1次,但单个珊瑚个体产生的精子和卵子量都很少,很难满足实验的需求,这给珊瑚科学研究增添了很多障碍.本实验利用组织压片和分子水平PCR扩增鉴定表明，短指软珊瑚共肉组织中部位没有虫黄藻分布,因此可利用该部分组织进行科学研究，这样就能排除虫黄藻的干扰.短指软珊瑚个体基部共肉组织粗壮,可以为珊瑚科学研究提供足够的实验材料.

本研究利用短指软珊瑚个体基部共肉组织进行全基因组测序研究,结果表明，软珊瑚SinulariaceramensisVerseveldt 基因组大小为649.58 Mbp,杂合率为1.25%,重复序列比例为57.06%.得到scaffold N50 为1 044 bp,总长为 599.11 Mbp.HUA等[17]1377的研究表明，石珊瑚A.millepora和A.digitifera基因组大小分别为386.60和447.48 Mbp,其 Scaffolds数目分别为3,876和 2,420,GC%含量分别为38.85 和39.04,基因重复率(%)分别为34.55和32.31.因此可知，石珊瑚基因组比短指软珊瑚基因组小很多,重复序列比率比短指软珊瑚基因组也小很多.表明光滑短指软珊瑚的基因组为1个复杂的基因组,需要采用相应的策略进行基因组组装.因此，在短指软珊瑚基因组注释方面今后还需深入研究.