高效液相色谱法测定维生素预混合饲料中的25- 羟基维生素D3

2020-05-19张浩然张亦菲华贤辉黄家莺上海市兽药饲料检测所上海201103

科学技术创新 2020年11期

张浩然徐汀张亦菲田恺华贤辉黄家莺*（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

25- 羟基维生素D3（25-OH-D3），是维生素D3在机体内的首个代谢产物，更易被吸收[1]。目前，25-OH-D3已广泛用于畜禽养殖业，用于提高蛋壳质量[2]、提高母猪怀孕率及窝产仔数[3-4]等。目前关于饲料中25-OH-D3含量测定的报道仅限于配合饲料及浓缩饲料[5-6],至于预混合饲料方面，仍为空白。此外，维生素预混合饲料中25-OH-D3的含量高，用量大，又是配合饲料和浓缩饲料中25-OH-D3的来源。因此，本文建立了维生素预混合饲料中25-OH-D3含量测定的方法以期为维生素预混合饲料的质量控制提供技术手段。

1 试验部分

1.1 仪器和试剂高效液相色谱仪（ACQUITY Arc，Waters 公司）；电子天平（AB265-S，梅特勒- 托利多公司，精度为0.01 mg）。25-OH-D3标准品（Dr. Ehrenstorfer 公司，纯度为98.2%，批号为G155330）；甲醇为色谱纯；试验用水为一级水；维生素预混合饲料样品来自于市场收集。

1.2 色谱条件采用Thermo AQUASIL-C18色谱柱（规格为100 mm×3.0 mm，粒径3 μm），检测波长为264 nm；50 μL进样；柱温箱温度为30℃；流动相：A 相为水，B 相为甲醇，梯度洗脱程序见表1。

1.3 试样溶液的制备称取维生素预混合饲料3 g 置于50 mL 棕色容量瓶中，加水10 mL，超声10 min，冷却；继续加入30 mL 甲醇，混匀，超声提取20 min，冷却，用甲醇定容，稀释至刻度，摇匀；移取20 mL 于离心管中，离心5 min（6000 转/min）取上清，过0.22 μm 滤膜，得到试样溶液。

1.4 标准储备溶液的制备称取25-OH-D3标准品25 mg，置于25 mL 棕色容量瓶中，加入适量甲醇，振摇使25-OH-D3溶解，用甲醇定容。于-20℃保存。

1.5 标准系列溶液制备移取标准储备溶液适量，用85%甲醇溶液逐级稀释至棕色容量瓶中，使浓度分别为25 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.05 μg/mL。

2 结果与分析

2.1 方法的线性与范围以浓度（x）为横坐标，相应峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性方程为y = 133964x -11009，相关系数为0.9998。结果表明，本方法在0.05μg/mL～25 μg/mL 浓度范围内，线性良好。

2.2 方法的检测限和定量限向空白基质中添加25-OH-D3对照品，按照本文1.3 前处理后，以信噪比大于等于3 的浓度作检出限，信噪比大于等于10 的浓度作定量限，确定了本方法的检出限为0.2 mg/kg，定量限为1 mg/kg。

表1 梯度洗脱表

2.3 方法的准确度和精密度以空白基质添加的方式，从50 mg/kg、150 mg/kg、300 mk/kg 三个不同浓度考察方法的准确度及精密度。结果表明，各浓度添加的回收率在87.9%～94.2%之间，RSD 在0.6%～2.2%之间结果见表2。

表2 方法准确度及精密度的试验结果（n=5）

表3 实际样品测定结果数据表（n=3）

2.4 样品测定采用本法对各类维生素预混合饲料样品进行测定。为确保结果准确，对各样品进行了本底浓度的加标。结果表明，维生素预混合饲料的测定结果在32.5 mg/kg ～220.8 mg/kg 之间，本底加标回收率在86.6%～94.8%之间，说明本法适用于维生素预混合饲料中25-OH-D3的含量测定，结果见表3。