TTC法快速测定白鲜种子生活力

雷慧霞， 于 营， 刘亚苓， 张新静， 邢丽伟， 鲁海坤， 吴健勇， 郭 靖

(中国农业科学院特产研究所， 吉林 长春 130112)

白鲜(DictamnusdasycarpusTurcz.)系芸香科白鲜属植物[1]，主产辽宁、河北、四川等地区，其根皮可以入药，具清热燥湿、祛风解毒之功效[2]。白鲜的繁殖方式分为有性繁殖和无性繁殖，种子繁殖可快速扩大栽培规模[3]。但其种子存在休眠特性，在种子育苗前必须先打破休眠[4]。黄卫红等发现，1～5 ℃沙藏处理白鲜种子可以促进种子萌发[5]。韩月乔等研究发现，白鲜种子经过50～100 mg·L-1GA3+低温层积处理，12～14周后发芽率接近80%[6]。由此可见，白鲜种子发芽率低且发芽周期长，给种子检验带来了一定的困难。TTC染色法是快速、准确测定种子生活力，判断种子发芽潜力的一种有效方法[6]。彭国平等[7]用红墨水染色法和TTC法分别测定了白鲜种子的生活力，测定结果仅为22.6%和23.3%。本实验分析了影响白鲜种子生活力测定的5个因素，以期筛选出TTC染色的最佳条件，以快速测定白鲜种子活力。

1 材料与方法

1.1 材 料

白鲜种子于2017年9月初购自辽宁省清原县英额门镇，种子千粒重10.90 g，种子含水量13.55%，保存于4 ℃冰箱内备用。

1.2 TTC染色法

1.2.1正交试验

本试验利用1份白鲜种子，采取L16(45)5因素4水平正交设计(见表1)，选择影响染色效果的浸种温度、浸种时间、TTC溶液浓度、染色温度和染色时间5个因素为检测指标，每个因素设置4个水平。

表1 正交设计因素水平

水平试验因素A浸种温度/℃B浸种时间/hCTTC浓度/%D染色温度/℃E染色时间/h12560.1256230120.33012335180.53518440241.04024

1.2.2TTC溶液的配制

用pH=7.0的磷酸缓冲溶液和2,3,5-氯化三苯基四氮唑粉剂配制成1.0%、0.5%、0.3%和0.1%TTC溶液[6]。

1.2.3种子浸种处理

将白鲜种子去除种皮，分别放入加入等量蒸馏水的三角瓶中，并使种子完全浸没，置于25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃恒温箱内，分别浸泡6 h、12 h、18 h和24 h。每个处理50粒种子，共设3次重复。

1.2.4种子染色处理

种子浸泡后取出，用滤纸将种子表面的水分吸干，用镊子去除胚乳和1片子叶，将留有种胚的那片子叶置于培养皿中[6]。将等量的1.0%、0.5%、0.3%和0.1%的TTC溶液加入培养皿中，至种子完全浸没，分别置于25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃的恒温箱内避光染色6 h、12 h、18 h和24 h后取出，用蒸馏水冲洗3次。观察染色结果，凡胚被染为红色的种子就是有生活力的种子。

表2 TTC法测定种子生活力的正交试验结果

处理组合因素A因素B因素C因素D因素E平均生活力1A1(25)B1(6)C1(0.1)D1(25)E1(6)67.33±2.49ef2A1(25)B2(12)C2(0.3)D2(30)E2(12)77.33±0.94cd3A1(25)B3(18)C3(0.5)D3(35)E3(18)73.33±3.39de4A1(25)B4(24)C4(1)D4(40)E4(24)60.00±2.82gh5A2(30)B1(6)C2(0.3)D3(35)E4(24)91.33±0.94 a6A2(30)B2(12)C1(0.1)D4(40)E3(18)88.00±1.63ab7A2(30)B3(18)C4(1)D1(25)E2(12)64.00±1.63fg8A2(30)B4(24)C3(0.5)D2(30)E1(6)82.66±3.77bc9A3(35)B1(6)C3(0.5)D4(40)E2(12)76.66±3.77d10A3(35)B2(12)C4(1)D3(35)E1(6)70.00±2.82ef11A3(35)B3(18)C1(0.1)D2(30)E4(24)56.66±0.94h12A3(35)B4(24)C2(0.3)D1(25)E3(18)72.00±2.82de13A4(40)B1(6)C4(1)D2(30)E3(18)58.66±2.49gh14A4(40)B2(12)C3(0.5)D1(25)E4(24)34.66±3.39i15A4(40)B3(18)C2(0.3)D4(40)E1(6)68.00±3.26ef16A4(40)B4(24)C1(0.1)D3(35)E2(12)28.00±3.26jⅠj278.00 294.00 240.00 238.00 288.00Ⅱj326.00 270.00 308.67 275.33 246.00Ⅲj275.33 262.00 267.33 262.67 292.00Ⅳj189.33 242.67 252.67 292.67 242.67Rj136.67 51.33 68.67 54.67 49.33

注：表中数据表示平均值±标准误差，同列不同小写字母表示p<0.01水平差异显著性。

1.3 种子发芽率测定

将白鲜种子用100 mg·L-1GA3溶液避光浸泡24 h，然后用1% NaClO浸泡消毒20 min[4]。将经过消毒的湿沙与种子以3∶1的体积比混匀，放入带盖塑料盒内，置于4 ℃冰箱中低温层积。种子发芽标准为胚根突破种皮2 mm以上，种子发芽前每10 d检查1次，开始发芽后每5 d统计1次发芽数，连续10 d没有种子发芽视为发芽结束[8]。每个重复50粒种子，共设4次重复。

1.4 数据处理

采用Excel软件进行数据处理，用SAS 9.2统计分析软件分析数据，筛选TTC染色法测定白鲜种子生活力的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 种子发芽率测定结果

白鲜种子发芽试验结束后，统计种子发芽数目，分别为46、44、43、45粒，得出白鲜种子的平均发芽率为89.00%。

2.2 种子生活力测定结果

白鲜种子生活力测定结果见表2。白鲜种子生活力最高值为91.33%，对应的组合为处理组合5，即30 ℃条件下浸种6 h、0.3%TTC浓度35 ℃条件下避光染色24 h，该组合的种子大部分被染成均匀的鲜红色，染色效果较好(见图1)。种子生活力测定的最低值为28.00%，对应的组合为处理组合16，即40 ℃条件下浸种24 h、0.1% TTC浓度35 ℃条件下避光染色12 h，该组合大部分种子被染成淡粉色或未染色，染色效果较差(见图2)。

2.3 极差分析

数据进行极差分析(见表2)，比较5个因素对白鲜种子生活力测定值的影响，极差值R1=136.67，R2=51.33，R3=68.67，R4=54.67，R5=49.33，即浸种温度对白鲜种子生活力测定值影响最大，其次是TTC浓度，而浸种时间、浸种温度和染色温度对测定值的影响均较小。

图1 白鲜种子30 ℃浸种6 h、0.3% TTC浓度35 ℃避光染色24 h后染色效果

对Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj、Ⅳj进一步分析，选取各个因素对应的最大值来代表适合白鲜种子生活力测定条件。浸种温度(因素A)中最大值为Ⅱ1=326.00，即浸种温度可以选30 ℃；浸种时间(因素B)中最大值为Ⅰ2=294.00，即浸种时间可以选6 h；TTC浓度(因素C)中最大值为Ⅱ3=308.67，即TTC浓度可以选0.3%；染色温度(因素D)中最大值为Ⅳ4=292.67，即染色温度可以选40 ℃；染色时间(因素E)中最大值为Ⅲ5=292.00，即染色时间可以选18 h。综上可得出，A2B1C2D4E3为较优组合，即白鲜种子在30 ℃条件下浸种6 h后，在40 ℃条件下用0.3% TTC溶液避光染色18 h。

图2 白鲜种子40 ℃浸种24 h、0.1%TTC浓度35 ℃避光染色12 h后染色效果

2.4 方差分析

进一步对数据进行方差分析，结果(表3)表明，试验设定的5个因素都对试验结果具有极显著影响(p<0.01)，说明浸种温度、浸种时间、TTC 浓度、染色温度和染色时间都是影响白鲜种子生活力测定的主要因素。

表3 方差分析结果

方差来源自由度平方和均方F值显著性浸种温度(A)37277.58 2425.86 207.44 **浸种时间(B)31016.25 338.75 28.97 **TTC 浓度(C)32002.92 667.64 57.09 **染色温度(D)31190.92 396.97 33.95 **染色时间(E)31574.25 524.75 44.87 **误差30350.83 11.69

注：R2=0.97，“**”表示在0.01水平上具有极显著差异。

3 结论与讨论

3.1 TTC法测定白鲜种子生活力的最佳条件

本试验中，白鲜种子生活力达到91.33%的为处理组合5，该组合的种子大部分被染成均匀的鲜红色，染色效果较好。数据分析结果表明，30 ℃浸种6 h，40 ℃条件下0.3% TTC溶液避光染色18 h为较优组合。将该组合与组合5相比较，除了染色温度和染色时间不同，另外3个条件都相同，该组合的染色温度为40 ℃，处理组合5的染色温度为35 ℃，该组合的染色时间为24 h，处理组合5的染色时间为18 h。极差分析表明，染色温度和染色时间对种子生活力测定值影响较小，处理组合5可以作为最优组合。综上所述，白鲜种子TTC染色的最佳条件为A2B1C2D3E4，即白鲜种子30 ℃浸种6 h后，35 ℃条件下0.3% TTC 溶液避光染色24 h。

3.2 TTC法测定白鲜种子生活力的可行性

TTC法测定的结果与发芽率一般很接近，而且种子生活力应该大于或者等于发芽率[9-11]。本研究中测得白鲜种子发芽率为89.00%，种子生活力为91.33%，种子生活力略高于发芽率。TTC法测定白鲜种子的生活力所需的浸种时间与染色时间相加仅为30 h，而测定白鲜种子发芽率则需要12～14周[4]，因此在生产中可先用TTC法测定种子的生活力来判断种子潜在的发芽能力并了解种子质量。