石榴果腐病病原的分离鉴定

畅引东，贾 俊，解宇洁，李荣荣，史锦淑，陈 兴，王建明

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.晋中市规划和自然资源局，山西晋中030600；3.太原师范学院，山西太原030619）

石榴（Punica granatum L.）为落叶乔木或灌木，在我国已有2 000 多年的栽培历史[1]。山西省晋南地区气候温和，日照充足，土层深厚，适合石榴的生长。该地区自古以来就有种植石榴的习俗，既有家庭院落栽培，也有集中成片种植[2]，现今仅运城临猗县年产石榴就可达4.5 万t[3]。近年来，随着社会经济的发展，人们对健康生活有了更高的追求。石榴果实因其含有丰富的天然活性物质，具有抗衰老、预防动脉粥样硬化和减缓癌变进程等作用[4-5]，越来越受到大众的青睐。市场需求的增大、政府“一村一品、一县一业”政策的实施，以及当地石榴种植传统优势等都极大地促进了当地石榴产业的发展。

随着石榴种植规模的扩大，地区间品种调用、产业升级等对石榴果园的管理提出更高的要求。石榴在生长和贮藏过程中极易遭受多种病原侵染，引起果树树势减弱、果实腐烂和商品性下降等问题。目前已发现的石榴病害主要由病原真菌侵染造成。截止目前，已报道的石榴病害的病原真菌主要有甘薯长喙壳（Catalysts fimbriation Ellis et Halted）、疫霉菌（Phytophthora sp.）、厚盘单毛孢（Monochaetia pachyspora Bubak）、石榴尾孢霉（Cercospora punicae P. Henn.）、石榴生尾孢霉（Cercospora punicola）、煤炱菌（Capnodium sp.）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.）、石榴垫壳孢（Coniella granati （Sacc.）Petr. & Syd）、柑 橘 葡 萄 座 腔 菌（Botryosphaeria rhodina（Berk.et Curt.）Shoemaker）、石榴拟茎点霉（Phomopsis punicae）、石榴痂圆孢（Sphaceloma punicae Bitancourt et Jenkins）、黑曲霉（Aspergillus niger V. Tiegh.）、青霉菌（Penicillium sp.）等等，分别引发石榴枯萎病（为害根茎）、石榴疫腐病（为害树干茎基部）、石榴叶枯病（为害叶片）、石榴褐斑病（为害叶片和果实）、石榴黑斑病（为害叶片和果实）、石榴霉污病（为害叶片和果实）、石榴炭疽病（为害果实，也可为害叶片和枝条）、石榴干腐病（为害果实和枝干）、石榴焦腐病（为害果实）、石榴蒂腐病（为害果实）、石榴疮痂病（为害果实）、石榴曲霉病（为害果实）和青霉病（为害果实）等10 多种病害[6-12]。这些病害中多数是由一些常见病原真菌侵染引起，在我国各地多有发生，也有个别是在多地已有发生的检疫性病害[6，8，10]。由此可见，加强对新病害的调查研究，对做好植物检疫工作具有重要的理论和实践意义。

近年，在山西省运城市洪洞县石榴果实上发现一种石榴病害。据农户描述，在最初仅发现有个别病果，后来几乎在所有果实上都产生了类似病斑。此现象在往年已有发现，之后该病害年年出现，喷施药剂防治效果欠佳。考虑到该石榴树所处农户院落紧邻石榴果园，其果实病状与以往发现果实病状有出入。因此，明确该病害的致病病原对该种病害的防治及当地石榴果业的健康发展具有积极的指导意义。

本研究对采集自山西省洪洞县的石榴病果，运用形态学和分子生物学鉴定相结合的方法明确引发该病害的致病病原，旨在为该病害的防治提供有效的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试石榴病果采集自山西洪洞县。

1.2 试剂与仪器

试验中选用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）、查氏酵母膏琼脂培养基（Czapek Yeast Extract Agar，CYA）和燕麦琼脂培养基（Oatmeal Agar，OA）[13]。

CTAB 缓冲液[14]、Taq PCR Mix 预混液、Green 核酸染色剂、1 倍TAE 电泳缓冲液、6 倍上样缓冲液、DNA marker D（100～2 000 bp）和DNA Marker S（100～5 000 bp）（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

净化工作台（SW-CJ-2FD，上海博迅实业有限公司），智能光照培养箱（GTOP-Y 系列，浙江托普仪器有限公司），OLYMPUS 光学显微镜（BX51，日本奥林巴斯），高压蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-70A，上海博迅实业有限公司），热空气消毒箱（GR-240，上海博迅实业有限公司），电子天平（BSA224S，德国赛多利斯），数显恒温水浴锅（HH-2，常州国华电器有限公司），高速离心机（Thermo Sorvall ST 16RT，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），PCR 仪（T100，伯乐（中国）有限公司），电泳仪（PowerPacTMBasic，伯乐（中国）有限公司），凝胶电泳成像分析仪Bio-Rad PCR 仪（Universal Hood ll，伯乐（中国）有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分离纯化 采用组织分离法于果实表面病健交界处切取3～5 mm 的正方体组织，在75%的酒精溶液内浸泡2～3 s，后用无菌水冲洗3 次，用灭菌滤纸吸干表面水分，移至PDA 平板上，在25 ℃的恒温培养箱中培养3～4 d，将组织上长出的菌落转接至新的PDA 平板进行纯培养，将分离菌株进行单孢纯化后转入PDA 培养基作为菌种保存备用[13]。病果内部病原菌的分离可用灭菌小刀切开石榴，挑取病果内部患病组织，放在PDA 平板上，于25 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，随后将分离菌株单孢纯化后转入PDA 培养基作为菌种保存备用[13]。

1.3.2 菌株致病性测定 采用致伤接种法[13]，在超净工作台内用75%酒精对石榴果实进行表面消毒，再用无菌水进行冲洗，晾干后备用；将纯化菌株制成浓度为1×106个/mL 的孢子悬浮液，采用针刺法接入健康石榴果实的中部，以无菌水接种作为空白对照，每个回接试验设3 次重复；将回接的石榴果实放入塑料盒内的培养皿上，用PE 保鲜膜封口，放置于25 ℃恒温培养箱内培养，培养皿与塑料盒之间的空隙处塞入无菌水浸湿的脱脂棉做保湿处理。随后每天观察果实的发病情况，并做记录。

1.3.3 菌株形态学鉴定 将纯化的菌株转接到PDA 平板上，此后3～7 d 测量菌落直径，在第4 天记录气生菌丝特性和培养物色泽，并在显微镜下观察菌株的分生孢子的有无、数量、大小、形状以及产孢结构等显微形态特征，记录并拍照；对在PDA 培养基上观察不到孢子的菌株，则转接至OA 培养基和CYA 培养基上进行培养，观察其有无孢子或子实体产生，以及其产生所需的时间，并对菌落特征和显微形态进行拍照和记录。最后参考《中国真菌志》和《真菌鉴定手册》[15-16]进行分类鉴定。

1.3.4 菌株分子鉴定 采用CTAB 法对菌株基因组DNA 进行提取[14]。以供试菌株基因组DNA 为模板，选用真菌通用引物ITS1（5′- TCCGTAGGTGAA CCTGCG-3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）对病原菌rDNA 的ITS 区进行PCR 扩增。总反应体系为20 μL，包括DNA 模板1 μL、Taq PCR Mix 预混液6 μL、ITS1 和ITS4 引物各1 μL，ddH2O 补足至20 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环34 次；最后72 ℃再次延伸5 min。扩增产物在恒压110 V 下用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果由上海生工生物工程有限公司进行测序，将得到的序列在NCBI 的GenBank 数据库中进行Blast 比对，获得相似度高的核苷酸数据，利用MEGA 6 软件对获取的序列构建邻接树进行系统发育分析[17]。

2 结果与分析

2.1 石榴病害症状

山西省洪洞县采集的石榴病果的病状为果实外部表面具有规则的圆形轮纹状病斑，边缘处为白色晕圈，由边缘至病斑中央色泽从黄褐色逐渐加深为棕褐色，轮纹中央为褐色至深褐色（图1-A）。石榴病果实内部已大部分褐化，自病果的萼筒处到果实内部布满黑褐色的霉层，且具有灰白色的菌丝。籽粒间松散，部分籽粒丧失水分，且上布满黑色、白色的霉层（图1-B）。采集的供试病果后期逐渐失水干枯，形成僵果。

2.2 菌株分离纯化和致病性测定结果

从采集的石榴果实样品中通过组织分离法和直接挑取分离法，共分离纯化得到3 种特征各异的真菌菌株，分别编号为SLX、SLY 和SLZ。经柯赫氏法则回接鉴定证明，3 种菌株接种后，菌株SLX 和菌株SLY 可以侵染石榴果实引起发病，而菌株SLZ则未能引起发病（图2）。从接种发病的果实上分离纯化的病原菌与该分离菌株在形态上相同，因此，可确定该分离物是病原菌。

菌株回接4 d 时，菌株SLX 回接果实表面出现黄色病斑，菌株SLY 回接果实表面出现灰白色点状霉层，菌株SLZ 回接果实表面与空白对照相同。在菌株回接4～7 d 时，菌株SLX 回接果实表面病斑逐渐向外扩大，中央出现黑褐色轮纹且伴有白色菌丝，边缘为淡黄色晕圈，从边缘至病斑中央色泽从淡黄色逐渐加深为棕褐色，中央出现黑褐色轮纹且伴有灰白色菌丝（图2-A）；菌株SLY 回接果实表面原先的灰白色点状霉层逐渐变为黑色霉层，黄褐色病斑逐渐扩大（图2-B）；菌株SLZ 回接后未能在石榴果实上侵染扩展，仅有稍许菌丝匍匐生长在果实表面（图2-C），与空白对照果实表面相同，无明显的病状（图2-D）。

2.3 菌株形态学鉴定结果

根据病原菌的菌落表面形态及显微形态，参照《中国真菌志》及《真菌鉴定手册》进行鉴定，结果表明，菌株SLX 为石榴垫壳孢（Coniella granati（Sacc.）Petr. &Syd），属半知菌亚门（Fungi Imperficti）壳霉目（Sphaeropsidales）壳霉科（Sphaeropsicaceae）。有性态为石榴小赤壳菌（Nectriella versoniana Sacc. et Penz），属 子 囊 菌 纲（Ascomycetes） 肉 座 菌 目（Hypocreales）丛赤壳科（Nectriaceae）。菌株SLY 为黑曲霉（Aspergillus niger），属半知菌纲壳霉目杯霉科（Discellaceae）。菌株SLZ 为黑附球菌（Epicoccum nigrum），属半知菌纲壳霉目杯霉科。

2.3.1 石榴垫壳孢Coniella granati（Sacc.）Petr.&Syd（菌株SLX） 在PDA 培养基上菌丝为白色，呈轮纹状向外扩展，菌丝稀疏，每轮菌丝呈波浪状。菌丝生长速率为1.0～1.1 cm/d（图3-A、B）。培养至7 d时已满皿，发现无产孢后接入CYA 培养基，菌丝为白色，初期呈放射状花朵形态向外展开，生长速率为1.2～1.3 cm/d（图3-C、D）。第5～6 天中央出现黑色分生孢子器，裸生或半埋生于培养基中，逐渐向外扩展，培养至第10～12 天时菌丝消失，黑色分生孢子器布满整个培养基（图3-E、F）。

在光学显微镜下观察到分生孢子器呈鹅蛋型，黑褐色，大小为（115～140）μm×（90～135）μm（图4-A、B）。产孢区有垫状凸起，呈雪花状的链式结构，无色光滑（图4-C）。分生孢子呈纺锤形，无色或淡褐色，无隔，表面光滑，大小为（9～13）μm×（3～4）μm（图4-D）。

2.3.2 黑曲霉Aspergillus niger（菌株SLY） 在PDA培养基上初期为白色，菌丝致密无褶皱。2～3 d 后长出黑色孢子，表面黑色丝绒状，中心凸起，有放射状沟纹，边缘有白色气生菌丝，粗糙（图5-A）。生长速率为0.4～0.5 mm/d，培养至7 d 时菌落直径达到4 cm（图5-B）。

在光学显微镜下观察到分生孢子梗为（25～30）μm×（150～200）μm，顶端的分生孢子头呈膨大球形顶囊，直径180～230 μm，淡黑褐色，顶囊产孢区全面覆有产孢梗，双层（图6-A）。分生孢子球形，光滑，直径为2.5～3.8 μm（图6-B）。

2.3.3 黑附球菌Epicoccum nigrum（菌株SLZ） 初期菌丝为粉色偏白，5 ～6 d 后由内向外颜色加深为橘粉色，后期中间菌丝呈环凸起，菌丝稠密，生长速率为3～5 mm/d，培养至7 d 时菌落直径达到3 cm（图7-A、B）。培养至12 d 时发现无产孢，接入OA培养基，菌丝为白色、稀疏，呈放射状平铺延伸，生长速率为6～7 mm/d，较PDA 生长速率快。4～5 d 后从中央向外逐渐生成黑色颗粒（图7-C、D），10～11 d时满皿，菌株中央产生的黑色颗粒较多，向外逐渐减少（图7-E）。

在光学显微镜下观察到无色光滑的菌丝体，宽1～2 μm，多数分枝。淡褐色短粗的分生孢子梗（3～5）μm×（1～2）μm，有隔（1～2 个）或无隔（图8-A）。分生孢子梗顶端膨大处生出球形分生孢子，初无色或淡褐色，后黄褐色、黑褐色，无隔。分生孢子表面粗糙，直径大小为20～30 μm（图8-B）。

2.4 菌株分子鉴定结果

以菌株SLX、SLY 和SLZ 的基因组DNA 为模板，用真菌通过引物ITS1/ITS4 对病原菌rDNA的ITS区进行PCR 扩增。经测序分析，3 个菌株SLX、SLY和SLZ 的扩增产物长度分别为518、559、585 bp，将所得序列在GenBank 序列数据库中进行同源序列比对，从中选取显示明确属种、一致性高、覆盖率高（＞98%）的序列，以尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）为外群，利用MEGA 6 软件进行的系统发育分析结果如图9 所示。

由图9 可知，3 个菌株通过聚类划分为3 组，组间的相关性存在明显差异。菌株SLX 与所选的石榴垫壳孢菌株（Coniella granati）的序列同源性达到99.82%以上；菌株SLY 与所选的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株的序列同源性达到99.12%以上；菌株SLZ 与所选的黑附球菌（Epicoccum nigrum）菌株的序列同源性达到99.61%以上。通过ITS 序列分析可将菌株SLX、SLY 和SLZ 分别鉴定为Coniella granati、Aspergillus niger 和Epicoccum nigrum。

3 结论与讨论

本试验通过形态学、分子生物学手段和致病性试验对引起山西省洪洞县石榴果腐病的病原进行了鉴定，明确引起果实腐烂的病原为石榴垫壳孢（Coniella granati）和黑曲霉（Aspergillus niger）。

据报道，石榴垫壳孢可在石榴生长期及贮藏期均可对石榴果实进行侵染。该病原易从萼筒处侵入。发病初期果实表面形成褐色病斑，中期病斑边缘产生黄色晕圈，后期果实失水皱缩，籽粒松散，成僵果状[18]。这与本试验中观察到的症状基本一致。黑曲霉对石榴果实的侵染则多发现于储藏期，易从伤口处侵入。初期果实表面形成黑色病斑，中期病斑扩大，并伴有黑色霉层，后期果实发生软腐，肉眼可见到黑色的子实体[19]。本试验从田间的发病幼果中分离出黑曲霉，表明黑曲霉在石榴生长期也可侵入寄主潜伏，在环境适宜时即可侵染发病。

值得注意的是，在病原菌的致病性试验中，2 种病原的致病症状与试验最初采集的病果上的症状不一致，在回接果实发病期间并未出现与供试病果一致的规则的圆形轮纹状病斑，但与文献报道的症状相一致[20]。这可能是由于接菌方式与原先病果受侵染的方式不同造成，也可能是由于其症状是由石榴垫壳孢和黑曲霉共同作用所导致的结果，其具体发病机制有待进一步研究。

石榴垫壳孢和黑曲霉病原引起病害的防治已有多种成熟的手段。对于石榴垫壳孢引起病害的防治，可在越冬期间铲除干枯的枝条及枝条上的老化翘皮，清除果园内的僵果，防止石榴垫壳孢对次年石榴果实进行再侵染；花期结束后喷施氟硅唑、腈菌唑，可有效减少石榴干腐病的发生[21]。对于黑曲霉引发病害的防治，可在果实成熟期中进行适当的通风散湿，雨后及时排水，可有效减少曲霉病的发生；在发病初期使用多菌灵或加瑞农能够有效防止黑曲霉继续侵染[22]。此外，通过对石榴果实进行套袋处理和除去花蕊，能有效减少病原菌的侵染，也可在果园中推广使用。