沙门氏菌烈性噬菌体的分离鉴定与生物学特性分析

仇笑笑

（山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025）

临床中沙门菌是一种广泛分布在自然界中的革兰氏阴性杆菌，可导致贝类、羊、猪、鸡、鸭等多种动物和人患病[1]。目前多采用抗生素抑制沙门菌增殖，但近年来随着抗生素药品的滥用，沙门菌耐药性显著提升，给国内养殖业带来巨大的经济损失。同时，沙门菌作为一种常见的食源性致病菌，对人类身体健康也产生了一定程度的影响[2]。临床中噬菌体能够特异性侵染细菌，通过自身特定配体同细菌表层特定受体相结合的途径裂解细菌，从而抑制病菌增殖，且沙门菌噬菌体仅会影响沙门菌合成，并不会对正常菌群产生不良影响，不受细菌耐药性的制约，属于天然、安全的抑菌剂[3-4]。为了探讨抗沙门菌的有效方法，利用噬菌体治疗细菌感染，就沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定与生物学特性进行如下探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选自临病死鸡中分离出的沙门氏菌菌株，垫料、粪便均源于山西省尖草坪区、长子县、高平市、临猗县和壶关县等地商品肉鸡场。

日立Hitachi H-9500透射电子显微镜；LB培养基、琼脂培养基购于北京陆桥公司；Beckman Coulter Avanti J-26S离心机；苏瑞电子设备(北京)有限公司提供的DNP-9082电热恒温培养箱；Millex-GV SLGVX13NL 1000细菌过滤器；上海知楚仪器有限公司提供的ZQZY-88BV型全温振荡培养箱。全部研究材料和用品均处于有效期内，器械性能正常。

1.2 方法

1.2.1 处理样本

采集鸡粪和垫料30 g，加入200 mL无菌生理盐水内，确保浸泡充分，自然沉降240 min后取上清液，12000 r/min离心处理15 min，再使用滤器过滤（0.22 μm），以滤液作为分离噬菌体的母液。

1.2.2 菌种复苏与菌悬液制备

复苏冷冻保存的沙门菌，挑取生长菌落转移至LB肉汤内，放置在全温振荡培养箱中培养，制备好菌悬液，备用。

1.2.3 采用双层平板法分离噬菌体

在操作过程中取1.2.1中的母液3 mL和增殖后的沙门菌菌悬液200 μL，均匀混合，震荡培养，维持温度37 ℃，过夜后采集培养后的增殖液在10 000 r/min条件下进行离心处理5 min，再使用细菌滤器（0.22 μm）进行过滤处理。取滤液200 μL与菌悬液100 μL均匀混合后，放置在37 ℃温箱内孵育5 min。将混合液添加至融化后冷却到45 ℃左右的含琼脂（0.7%）LB上层琼脂内，均匀混合，将上层琼脂倒进下层营养琼脂中，等待凝固，再放置在温箱内培养8～10 h，温度37 ℃，观察噬菌斑生长情况。

1.2.4 纯化噬菌体

使用无菌镊子扣取培养基内的单个噬菌斑，将其放置在装有1 mL生理盐水的无菌离心管，水浴30 min，温度40 ℃，待水浴完毕立即在10 000 r/min条件下予以离心处理5 min，适度稀释浸出液，将其与宿主菌铺在双层平板上，重复扣取单个噬菌斑实施纯化操作，直至获取形态、大小均一的蚀斑为止，共纯化7代。

1.2.5 测定噬菌体效价

使用液体增值法测定效价，扣取单个噬菌斑后制备噬菌体浸出液，采集浸出液500 μL和宿主菌悬液200 μL，与LB肉汤均匀混合后震荡培养，温度37 ℃。取增值液在10 000 r/min条件下进行离心处理5 min，适度稀释后采集200 μL并与宿主菌100 μL铺双层平板进行效价检测。

1.2.6 测定噬菌体裂解谱

使用点样法进行检测，采集待测菌悬液100 μL，转移至琼脂平板上，使用无菌棉签涂匀，确认菌液吸收完全后取噬菌体增值液2.5 μL，点涂至涂好菌的琼脂培养基上，确认噬菌体增值液被完全吸收后，将琼脂培养基放置在温箱内孵育10 h，温度37 ℃。

1.2.7 观察噬菌体形态

取15 μL噬菌体增值液，添加至微孔铜网上进行自然沉降，15 min后借助滤纸吸收多余液体，再滴加2%磷钨酸10 μL实施染色处理，使用滤纸吸除多余液体，自然干燥后利用电镜观察噬菌体形态。

1.2.8 噬菌体温度稳定性试验

取噬菌体增值液150 μL，转移至1.5 mL离心管中，放置在 40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和 80 ℃的水浴中，掌握水浴作用20 min、40 min和60 min的效价变化，各温度梯度重复2次，观察噬菌体效价在不同温度梯度中的变化情况。

2 结果

2.1 噬菌体分离结果

经本次实验，成功分离到噬菌体1株，命名为CR5，经过7代纯化处理后，通过增殖进行效价测定，发现效价为109PFU/mL。

2.2 噬菌体裂解谱的测定

CR5可成功裂解实验室储存的33株沙门菌中的17株，属于宽裂解谱噬菌体。

2.3 噬菌体电镜观察

经透射电镜可清晰观察到噬菌体CR5由多平面体头部及细长尾部构成，头部呈六边形，直径约为50 nm，尾部长度约为110 nm，详见图1。

2.4 噬菌体温度稳定性实验

观察噬菌体效价在不同温度梯度中的变化情况，结果发现，噬菌体CR5效价随温度变化会发生相应的变化，具体情况如下：在40 ℃作用1 h后，噬菌体CR5仍可维持原有活性，在50 ℃、60 ℃状态中20 min后效价下降，但仍可达到109PFU/mL；在70 ℃状态下20 min后，CR5效价快速下降，降至106PFU/mL，在作用1 h后效价降至25 PFU/mL；在80 ℃状态中20 min后即完全失活。温度对噬菌体CR5的影响见图2。

图1 噬菌体CR5电镜下形态

图2 噬菌体CR5的热稳定性

3 讨论

近年来，多重耐药沙门菌在全球各地均有报道，因此有效防控沙门菌感染已成为养殖产业关注的重要问题，相关动物实验结果表明，噬菌体可有效抑制沙门菌感染，与抗生素比较无耐药性缺陷，可依赖宿主菌完成复制，具有使用剂量小、专一性强、对正常菌群副作用低的优势[5]。噬菌体在自然环境中分布广泛，为人类提供丰富抗菌资源库，目前被分离、利用的噬菌体较少。有学者[6]研究后发现，噬菌体能够在宿主菌上吸附，并在宿主菌内部生长、增殖，对耐药宿主菌进行裂解，为沙门菌临床抗感染治疗提供了思路，具有重要的参考意义。本次研究中分离得到的噬菌体CR5效价达到109PFU/mL，且电镜观察结果提示，噬菌体CR5呈长尾状。分析后可知，双层平板上裂解性噬菌体的蚀斑边缘清晰、形状规则、透亮，能够清晰观察噬菌体形态，发现噬菌体CR5由头部和尾部两部分组成，属于长尾科。而裂解性噬菌体能够通过裂解宿主菌细胞，加快细菌死亡，在致病菌防控中发挥着积极的作用。本次分离得到的噬菌体CR5对实验室保存的33株沙门菌中的17株进行了成功裂解，裂解性较好，但仍有部分沙门菌未得到裂解，提示CR5仅能够裂解部分种类的沙门菌，具有一定的应用价值。

江艳华[7]对分离到的一株沙门菌噬菌体进行生物学特性分析后发现，噬菌体具有较好的温度耐受性，可逐渐降低宿主菌数目，能够作为生物抑菌剂防控沙门菌感染。陈义宝等[8]实践后发现，使用双层平板法筛选、纯化沙门菌噬菌体，并利用电镜观察噬菌体形态，可了解沙门菌噬菌体的生物学特性，发现该噬菌体对不同温度均具有较强的适应能力，裂菌效果良好，可作为抗沙门菌制剂进行开发。噬菌体CR5不同温度下的活性试验证实该种噬菌体具有较好的温度耐受性，在低温环境中可有效降低宿主菌数量，在较高温度条件下（40～60 ℃）可于一定时间内（1 h）降低宿主菌数目，之后受残留宿主菌繁殖速度超过噬菌体裂解速度因素影响，导致抑菌效果受限。因此在宿主菌处于抑制条件时具有良好的裂菌效果，临床中可通过调控温度与联合使用其他抗菌制剂的方式，增强抑菌效果。

4 结论

对分离到的噬菌体实施纯化、裂解谱检测、效价检测、电镜形态观察后发现，沙门菌噬菌体温度耐受性较好，属于一种长尾科、强裂解性噬菌体，能够有效发挥抑制沙门菌的效用，具有积极的应用意义。