基于流式细胞术的桫椤基因组大小测定

黄雄，郭英华，田林，李全梓，岳志强

(中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091)

基因组大小的测定不仅对物种的分子遗传与细胞遗传研究具有重要意义，也为其基因组学及其亲缘进化研究以及生态学研究提供重要参考[1]。目前，测定基因组大小的方法有孚耳根微显影法、基因组测序法和流式细胞术[2–4]。流式细胞术是一种对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选的生物学计数方法，具有操作简单、分析速度快、结果相对准确的优点，被广泛应用于物种基因组大小的测定[5–7]、核型分析[8]和细胞计数[9]等方面的研究。

桫椤(Alsophila spinulosa)是孑遗植物，属桫椤科(Cyatheaceae)桫椤属(Alsophila)，别名树蕨、蛇木等，是现存唯一的木本蕨类植物，株高可达数米，有“蕨类植物之王”的美誉[10–11]，目前处于濒临灭绝状态，被列为国家一级野生保护植物[12–13]。桫椤的生长对环境的要求较高，喜阴冷潮湿，在中国仅分布于南方和西南地区[14]。桫椤的茎干有较好的药用价值，具有润肺止咳、除湿祛风等功效，被称为“龙骨风”。目前，对桫椤化合物成分[15–16]、配子体和孢子体[17]、染色体数目与核型[18]、栽培技术[19]等方面进行了较多研究，但有关桫椤基因组大小的研究尚少见报道。本试验中，以买麻藤为内参，采用流式细胞仪对桫椤的基因组大小进行分析，旨在为今后开展桫椤属植物基因组学的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

桫椤采自四川省洪雅县桫椤国家种质资源库(N29°52′，E103°11′)；买麻藤由中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室提供。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：流式细胞仪(BD Influx)、荧光显微镜(Carl Zeiss)、离心机(Thermo Fisher Scientific)。

裂解液：Tris·MgCl2[20]、LB01[21]、WPB[22]、Otto’s[23]、Galbraith’s[24]，配方详见表1。

表1 5种细胞核裂解液的配方Table 1 Component of five nuclear lysis buffers

供试试剂：碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染液、PBS溶液、鞘液。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞核悬液的制备

在预冷的培养皿中加入1 mL预冷的裂解液，放入约0.2 g桫椤和0.1 g买麻藤幼嫩叶片，用刀片切碎后，再加入1 mL预冷的裂解液，使材料全部浸没在裂解液中。裂解5 min后，用1 mL移液枪吸取培养皿内的裂解液，过筛(孔径为 48 μm)至 2 mL离心管中，离心(3 000 r/min)8 min。弃上清液后，将细胞核沉淀置于 4 ℃冰箱保存，备用。每种裂解液各做3个平行实验。

1.3.2 DNA特异性染色

向细胞核沉淀中加入 500 μL预冷的碘化丙啶(PI)染料，用移液枪将聚集成团的细胞核分开，置于4 ℃冰箱中，避光染色15 min。

染色后，离心(3 000 r/min)4 min，弃上清液，再加入 30 μL预冷的 1%PBS溶液，重悬沉淀后，用移液枪吸取10 μL核悬液于载玻片上，于荧光显微镜下观察细胞核染色情况。

1.3.3 流式细胞仪检测

将染色后的细胞核沉淀移至上样管，加入500 μL鞘液，充分混匀后上机检测。采用波长为488 nm的激光，收集610/20通道的荧光，检测PI的发射荧光强度。每个样品至少收集 2万个细胞核(不包括碎片)。测定所得的数据由仪器自带的BD FACS软件进行处理分析，计算细胞核 DNA的含量。

2 结果与分析

2.1 裂解液的筛选结果

用 5种裂解液处理桫椤幼嫩叶片后，发现叶片颜色变化有所差异。用WPB、LB01裂解的叶片呈绿色，用 Tris·MgCl2、Otto’s、Galbraith’s裂解的叶片呈褐色或深褐色。在荧光显微镜下观察，发现 WPB和 LB01的裂解效果较好，能很好地将细胞核游离出来，细胞核的数量较多，背景杂质和碎片较少；Tris·MgCl2、Otto’s、Galbraith’s 裂解出的细胞核数量较少，呈零星分布，大部分为背景杂质和碎片(图1)。LB01裂解液中含有 β–巯基乙醇[25]，是一种有毒物质，对人体有害。综合来看，WPB为本研究筛选的最佳裂解液。

图1 细胞核的染色荧光检测结果Fig.1 Nucleus fluorescence detection after staining

2.2 基因组大小的测定

对比分析待测样品桫椤与买麻藤单独测定的结果，发现桫椤测定峰的位置和买麻藤的没有重叠干扰，也没有在买麻藤测定峰 1/2或 2倍的位置，排除了2个物种2C DNA和4C DNA峰的交叉影响，保证了用买麻藤作内参的准确性(图2)。

图2 流式细胞仪的检测结果Fig.2 The peak graph of FCM detection

采用 BD FACS软件对桫椤和买麻藤混合样品进行流式结果分析。从分析结果(图3)可以看出，桫椤和买麻藤的荧光峰图能较好地分开，曲线平滑，峰形较佳。根据 3次测定结果(表2)，可计算出桫椤的 2C DNA荧光峰值是买麻藤 2C DNA荧光峰值的1.475倍。根据买麻藤的基因组大小4.07 Gb[26]，计算得到桫椤基因组大小为6 003.25 Mb。

变异系数(CV值)是流式细胞术中检验精准度的一个标准，CV值越小，说明细胞核完整性越好，碎片越少。从表2可以看出，所有测定结果中的变异系数 CV值均控制在 4%以下，进一步保证了实验结果的可信度。

图3 桫椤和买麻藤混合样品流式细胞仪的检测结果Fig.3 The peak graph of FCM detection for mixed samples

表2 桫椤和买麻藤混合样品检测荧光峰值Table 2 The FCM detection statistical results for mixed samples

3 结论与讨论

在用流式细胞术测定物种基因组大小时，裂解液的筛选至关重要。本研究中，对 5种裂解液进行综合筛选，WPB裂解液能很好地裂解桫椤细胞，释放出细胞核，且杂质少，可降低不必要的干扰信号；LB01裂解液对桫椤也有较好的裂解效果，但 LB01裂解液中的 β–巯基乙醇对人体有害；综合分析，WPB为本研究桫椤最佳裂解液。

研究[27–28]表明，所选取的参照植物与待测物种的基因组大小相差越大，误差就越大，结果越不准确。本研究以买麻藤作内参，单独对买麻藤和桫椤进行测定时，两者的荧光峰图没有重叠，区分度好，且二者峰图相近，表明它们的基因组大小相近；同时，买麻藤基因组已被全基因组测序，其组装质量很好，充分保证了用买麻藤作内参的可靠性。通过流式细胞仪检测桫椤和买麻藤混合样品细胞核 DNA，计算得到桫椤基因组大小为 6 003.25 Mb。桫椤基因组大小的测定可为今后开展桫椤属植物基因组测序、文库构建和基因组学等相关研究提供参考。