炎症体在百草枯中毒致肺纤维化过程中的作用

张汉妤，薛飞，吴本鹤，徐继扬

（江苏省苏北人民医院 急诊科，江苏 扬州 225000）

0 引言

百草枯是一种控制阔叶杂草生长的高效、非选择性除草剂。化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，分子式为C12H14N2·2Cl，相对分子为257.2。百草枯中毒患者常出现多器官功能障碍而死亡，其中肺脏是损伤的主要靶器官，引起肺充血、出血、水肿、透明膜形成和变性、增生、纤维化等改变，导致急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等，如能度过急性期，后期亦可因不可逆的肺间质纤维化引起呼吸功能衰竭而死亡[1]。

炎症体（Inflammasome）是由多种蛋白质组成的复合体，已知发现的炎性小体一般均含有凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、caspase 蛋 白 酶 以 及 一 种NOD 样 受 体（NOD-like receptor，NLR）家族蛋白（如NLRP3）或HIN200 家族蛋白（如AIM2）。炎症小体能够识别病原相关分子模式（PAMPs）或者宿主来源的危险信号分子（DAMPs），招募和激活促炎症蛋白酶caspase-1。活化的caspase-1 切割IL-1β 和IL-18 的前体，产生相应的成熟细胞因子。炎症小体的活化还能够诱导细胞的炎症坏死[2]。本实验通过检测在百草枯中毒导致大鼠肺纤维化的过程中NLRP3、caspase-1的表达及下游IL-1β 和IL-18 分泌的情况，探讨炎症体在百草枯中毒致肺纤维化过程的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂。百草枯试剂购于南京红太阳生物化学有限责任公司，MPO、MDA、SOD 试剂盒购自南京建成生物公司，IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒购于美国R&D 公司，RNA 提取试剂Trizol Reagent 及rt-PCR 试剂盒购于美国Invitrogen 公司。

1.2 实验动物及分组。清洁级健康雄性SD 大鼠20 只，8-10周龄，体重200-220 g，购买于上海斯莱克实验动物有限公司。按照随机数字表法将大鼠分为百草枯中毒组，对照组，每组10 只。

1.3 动物模型制备及标本采集。百草枯中毒组（PQ 组）：20%百草枯溶液按照20 mg/kg 的剂量一次性腹腔注射；对照组：同一时间点腹腔注射等量的生理盐水。在标准动物饲养间内，给予无菌水和食物饲养。于中毒后3 天腹腔注射2.5%戊巴比妥钠2 mL/kg 麻醉并处死大鼠，采集腹主动脉血及肺组织用于指标检测。

1.4 肺组织髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）以及超氧化物歧化酶（SOD）含量测定。取100 mg 肺组织搅碎后溶于缓冲液中做成5%组织匀浆，严格按照检测试剂盒说明书步骤进行检测，MDA 含量采用硫代巴比妥酸比色法，SOD 含量检测采用黄嘌呤氧化酶法。

1.5 血清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 含量测定。动脉血常温静置15 min 后，1500 r/min 离心10 min 收集血清，使用ELISA 试剂盒严格按照说明书检测血清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 含量。

1.6 肺组织中NLRP3、caspase-1 mRNA 含量测定。取50-100mg 肺组织用液氮在研钵中研磨成粉末，加入1 mL Trizol 试剂提取总RNA，使用紫外分光度计定量，根据结果进行反转cDNA，-20℃保存。取适量的cDNA，加入Tap聚合酶，进行扩增。实验过程严格按照rt-PCR 试剂盒步骤进行，同时运用Primer Premier 5 设计各引物。使用2-△△Ct法计算NLRP3、caspase-1 mRNA 相对表达量。

1.7 统计学分析。用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，组间比较用非配对t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况。PQ 组大鼠中毒后逐渐出现躁动不安、精神萎靡、饮食下降、毛发蓬松、口唇发绀、呼吸急促、四肢无力等表现，在中毒后第3 天时表现最为明显。对照组大鼠外观及活动状态正常，自由活动，正常摄食、饮水。直至处死时，大鼠均存活，无死亡。

2.2 肺组织中的MPO、MDA、SOD 含量的比较。与对照组相比，PQ 组大鼠肺组织中的MPO 和MDA 含量明显升高，SOD 含量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 两组大鼠肺组织中MPO、MDA、SOD 含量

2.3 血清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 含量的比较。与对照组相比，PQ 组大鼠血清中的炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 的含量均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 两组大鼠血清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α 含量

2.4 肺组织中NLRP3、caspase-1 mRNA 的表达：与对照组比较，PQ 组大鼠肺组织中的NLRP3 和caspase-1 mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 两组大鼠肺组织中NLRP3、caspase-1 mRNA 的相对表达量

3 讨论

目前，百草枯中毒导致肺纤维化的过程中包括两个主要的病理变化：肺泡损伤和肺泡上皮细胞的重构；氧化应激反应、炎症反应和基因表达的异常，作用于肺纤维化形成的整个过程。关于急性百草枯中毒致肺纤维化的发生机制，主要包括氧化应激反应，炎症反应，肺泡损伤，肺泡上皮细胞重构，基因表达异常[3]，但其具体发病机制尚不明确。目前主要认为氧化应激反应和炎症反应是其中最重要的两个方面。1、氧化应激反应：目前认为氧化损伤是百草枯中毒的主要机制，PQ 吸收入血后，首先被还原型辅酶Ⅱ（NADPH）还原为PQ+，然后与氧作用形成O－和PQ2+，在SOD 的歧化作用下形成过氧化氢，再在Fe2+的催化下生成活性更强的羟自由基[4]。羟自由基可以从细胞膜的多不饱和脂肪酸中摄取氢原子，从而引起脂质超氧化物的产生[5]。超氧化物破坏细胞膜结构，导致细胞变性坏死，从而产生急性肺损伤和肺纤维化。MDA 是氧自由基介导的脂质过氧化反应的产物，MDA的量反映机体内脂质过氧化的程度。SOD 是肺内抗脂质过氧化系统的主要酶，SOD 能清除超氧阴离子。本实验研究中发现，PQ 组大鼠肺组织匀浆中MDA 含量较对照组明显升高，SOD 含量明显下降，这表明百草枯中毒的大鼠体内出现了氧化应激反应。②炎症反应：PQ 中毒除了直接的细胞毒性外，还通过激活巨噬细胞、中性粒细胞以及嗜酸性粒细胞等强致炎性细胞合成和释放大量的细胞因子、前炎性递质、趋化因子等，加重急性肺组织损伤和促进肺纤维化的形成。MPO是中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞分泌的血红素蛋白酶，MPO 的表达水平能够反映多形核白细胞的活性和功能[6]。对百草枯致急性肺损伤大鼠模型进行肺组织病理组织切片以及支气管肺泡灌洗液分析，可以发现MPO 的含量也明显升高，而且肺纤维化的程度与MPO 的含量成正相关。本实验研究中发现PQ 组大鼠肺组织匀浆中MPO 含量较对组明显升高，且血清中IL-6、TNF-α 等炎症因子明显升高，这说明百草枯中毒的大鼠体内出现了炎症反应。

炎症体是固有免疫被激活后所形成的一类多蛋白复合物，参与剪切pro-caspase-1，使caspase-1 解离后具有生物活性，促进IL-1β 及IL-18 成熟分泌致胞外，诱导炎症反应产生及炎症因子的表达。炎症体主要包括Nod 受体P1（NLRP1）、NLRP3、IPAF 以及AIM2 等四种，在巨噬细胞表达并介导巨噬细胞活化的主要是NLRP3 炎症体[2]。在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中存在NLRP3 和IL-18 表达的增加[7]；在矽肺肺纤维化大鼠模型肺组织中的NLRP3 及其下游因子caspase-1、IL-1β、IL-18 也存在高表达[8]；他汀类药物可促进肺泡巨噬细胞中的NLRP3 炎症体的活化和IL-1β 表达增高，进而导致肺纤维化的发生[9]；这些研究表明炎症体通路参与急性肺损伤及肺纤维化的发病过程[10]。值得注意的是，急性百草枯中毒致肺纤维化患者中，其血清IL-1β 及IL-18 表达水平明显升高[11]，提示此类患者中存在炎症体活化。本实验研究中发现，PQ 组大鼠肺组织内的NLRP3、caspase-1 的mRNA 的表达明显增加，且血清中IL-1β、IL-18 的含量也明显增加，这说明了在百草枯中毒导致大鼠肺纤维化的过程中有炎症体活化。

综上所述，本研究通过测定百草枯中毒大鼠体内的IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1 的水平，初步证实百草枯中毒大鼠体内的NLRP3/caspase-1 信号通路被激活后致使下游IL-1β 和IL-18 被剪切成熟并进一步参与炎症反应，从而导致肺纤维化的形成。因此深入研究炎症体活化在百草枯致肺纤维化过程中的具体机制具有重要意义，将为百草枯中毒致肺纤维化的靶向治疗提供有力的理论依据。