川滇高山栎氮磷含量快速测定研究

肖 聪，陈小玲,方睿霞,高艳菊,张 东,王石发,王保秀,杨青松*

（1.云南民族大学民族药资源化学国家民委教育部重点实验室，云南 昆明 650500；2.云南民族大学民族医药学院，云南 昆明 650500）

近年来连续流动分析仪被大量应用于各个领域，如测定土壤氨氮、硝态氮和有效磷[1-2]，测定水中氨氮的方法比较[3]、复混肥料中硝态氮[4]，同时测定橡胶叶全氮、全磷、全钾的方法研究[5]，快速测定全氮、全磷含量[6-7]。AA3连续流动分析仪拥有先进的自动化技术优势和超700种被认证的方法应用，由于自动化和模块化设计，AA3可以很容易地适应各实验室特殊的技术和实验要求，可根据相应方法分析40～100个样品/h，120～180个样品/d。能够分析各类型澄清液体样品，如水（海水/自来水/废水）、土壤（浸提液/消煮液）、植物（消煮液）、食品（饮料）、肥料、化合物等。

川滇高山栎 (Quercus aquifolioides Rehd.et Wils.)系壳斗科栎属的植物。分布于云南、西藏、贵州、四川等地，常生长在山坡向阳处或高山松林下[8]。常与其他高山栎类树种混生，是我国西部和西南部青藏高原东缘以及横断山地区所特有的一种植被类型，其分布区内对环境条件有极强的生态适应性，使得东喜马拉雅和横断山地区的森林覆盖率大大增加，在当地生态系统中起着至关重要的作用[9]。前人对川滇高山栎研究多集中在生态功能研究方面[10-13]，对川滇高山栎植物营养方面的研究较少，其中利用AA3型连续流动分析仪快速测定高山栎枝叶氮磷养分方面的研究尚未见报道。本文对AA3型连续流动分析仪测定川滇高山栎枝叶消解样品中全氮/全磷含量的方法进行研究，获得高效、精确的方法，以提高AA3型连续流动分析仪测定川滇高山栎全氮/全磷养分含量的质量和效率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品：川滇高山栎枝叶试验样品，均为野外采集；采样点为云南省昆明市禄劝县轿子雪山。国家一级标准物质：GBW07603（GSV-2）灌木枝叶购自中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所。

实验试剂：钼酸铵(NH4)6Mo7O24·4H2O、磷酸二氢钾KH2PO4、抗坏血酸C6H8O8、酒石酸锑钾K(SbO)C4H4O6·1/2H2O、硫酸钾 K2SO4、十二烷基硫酸钠（SDS）C12H25NaO4S、优级纯、10%次氯酸钠NaOCl、浓硫酸H2SO4（比重 1.84）、浓盐酸 HCl（比重 1.18）、30%过氧化氢 H2O2、硫酸铵 (NH4)2SO4、Brij-35 溶液 22%、硫酸钾K2SO4、氢氧化钠NaOH、磷酸氢二钠 Na2HPO4、水杨酸钠 Na2C7H5O3、硝普钠 Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O、酒石酸钾钠C4H4KNaO6·4H2O。 除特殊说明外所有试剂为分析纯，水为去离子水。

主要实验仪器：AA3型连续流动分析仪CFA，由德国SEAL公司生产，二通道，均为 MT7模块；SH230N石墨炉重金属消解仪 （可控温控时，配套30根100mL玻璃消煮管）；WGL-125B电热鼓风干燥箱（可控温控时）。

1.2 方法

1.2.1 样品待测液的制备

前处理：将采集的新鲜高山栎枝叶放入105℃烘箱中杀青30 min，再用75℃烘干至恒重（需要8～12 h）。最终粉碎后装入密封袋。

消煮具体步骤：采用硫酸-过氧化氢法消煮植物样，精密称取样品和标准物质0.0500 g于50 mL刻度的玻璃消煮管中，加入0.5 mL去离子水，润湿样品后加入1.2mL浓H2SO4，摇匀，静置过夜。消煮程序：150℃ 1h，200℃ 1h，240℃ 1.5h，消煮至样品呈黑酱油状态。将消煮管取出稍微冷却约1 min后，在溶液中间加过氧化氢10滴，边滴加边摇匀，直至消煮液变为更澄清的黑酱油状态，基本没有固体。再加5滴过氧化氢，消煮液颜色呈深黄色的澄清液体。样品统一滴加过氧化氢的滴数和次数，反复消化，直至变无色后继续再消化20 min除去残留的过氧化氢。最后加去离子水约50 mL于消解管中，待冷却稳定后转移至100 mL带盖比色管中定容及混匀（酸度为1.2%H2SO4）。同时做空白试验，标准物质和样品同样处理。将制备好的待测液于4℃冰箱保存。

1.2.2 全氮和全磷标准溶液配制[14～15]

全氮标准贮液（1000 mg N/L）：精密称取已在烘箱130℃烘3h的硫酸铵4.717 g，溶于600 mL去离子水中，定容至1L后摇匀，于4℃冰箱保存。全磷标准贮液（1000 mg P/L）：精密称取已在烘箱130℃烘3h的磷酸二氢钾4.394 g，溶于600 mL去离子水中，定容至1L后摇匀，储于4℃冰箱保存。

取全氮标准贮液 （1000 mg N/L）0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 和全磷标准贮液（1000 mg P/L）0、0.1、0.2、0.3、0.4mL于5个100 mL的容量瓶中，在每个容量瓶中加空白消煮液1.2 mL，用去离子水定容后摇匀。 其中含 N：0、2、4、6、8 mg/L，含 P：0、1、2、3、4 mg/L。

1.2.3 AA3型连续流动分析仪操作步骤[16]

CFA具体操作步骤参照操作规程按部进行，简单步骤为：开主机开泵，预热2h，待气泡稳定后打开软件、进样器和检测器，待泵停下后点图表选择分析方法，出现运行页面，关闭不需要的通道运行页面。设置灯值和基线，待水基线稳定在5%（约30min），放入试剂，检查试剂吸收（12 min 左右），试剂吸收满足条件后设置增益（约15 min），增益成功后设立分析方法，关闭通道运作分析文件，运行结束后取回报告，输出并分析数据，最后用系统清洗液慢速清洗管路15 min。

本次试验测全氮全磷含量时，仪器所使用的通道为channel-2通道，基线默认5%，增益初始值为10（增益值应小于100，不然峰形不稳定），增益最高峰为85%，视图平滑度设为16，设置了漂移基线校正杯和带过杯。测定样品时要先检查试剂吸收和仪器灵敏度。试剂吸收和仪器灵敏度公式为：相对于水的试剂吸收值=[试剂吸收（%）-水基线（5%）]/100%；设置试剂基线为5%，泵入氮磷标准最高杯，当标准溶液到达检测器且峰信号出现时，记录其峰高（%），则灵敏度=[最高标曲峰高（%）-试剂基线（5%）]/100%，灵敏度结果会在样品运行结束后自动计算，出现在实验分析报告上。

1.2.4 统计分析

所有实验数据均采用Excel 2013软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 试剂配制方法的调整和特性参数的设置结果

参照仪器所附方法和文献[5,14-15]，试剂配置方法做了相应的调整 （样品消解后最终酸度为1.2%H2SO4）。根据最终样品酸度，全磷全氮进样器清洗液为1.2%H2SO4（试剂管①，图1），空气管为②⑤，进样管为④或⑦。

全氮的试剂配制方法：

未做改变的试剂为水杨酸钠溶液 （试剂管⑧，图1），稀释水为去离子水（试剂管⑩）；其余试剂作如下调整：缓冲溶液（试剂管③⑥，图1）称取35.3 g十二水磷酸氢二钠和50 g酒石酸钾钠溶于400 mL的去离子水中，用小烧杯称取22 g氢氧化钠，转移至上述溶液中，混合均匀后后稀释至1 L。最后在瓶中加入2.73 mL Brij-35（22%）。要尽快用完，即使放入4℃冰箱，一天后出现浑浊，不可使用；次氯酸钠溶液（试剂管⑨，图1）配制方法为取10%次氯酸钠10mL，用9.05 mL的去离子水稀释成5.25%次氯酸钠，取7 mL 5.25%次氯酸钠溶液至60 mL水中，稀释至100 mL，混匀，每天更新。通过试剂配制调整，全氮反应尾液最终pH值为12.89，符合要求。

全磷的试剂配制方法：

未改变试剂为抗坏血酸溶液（试剂管⑩，图1），稀释水为去离子水（试剂管⑧，图1）；将仪器所附方法中盐溶液配置的酸去掉，将酸溶液换成系统清洗液，钼酸铵溶液（试剂管⑨，图1）配制方法为：将71 mL的浓硫酸缓慢加入800 mL的去离子水中，将6.2 g钼酸铵溶于其中，将溶解于水中的0.17 g酒石酸锑钾溶液加入上面溶液，最后稀释至1000 mL（其中含2.6 mol/L的1/2 H2SO4），混匀后储于棕色瓶，每周更新。要将酒石酸锑钾先溶解再与其他溶液混匀，这样更容易溶解，试剂吸收也会更低；盐溶液（试剂管⑥，图1）配制方法为将5 g氯化钠溶于700 mL的去离子水，并稀释至1 L；系统清洗液为0.2%SDS（试剂管③，图 1）：因 SDS的量影响试剂吸收，所以将2g SDS的量改为1g。

此次实验全氮和全磷用的都是高浓度进样管进样，测定范围为全氮 0～12 mg/L，全磷 0～6 mg/L。测定速率为50个样/h，比仪器方法60个样/h要小，使得增益值良好且视图更稳定。由表1可知，氮磷的灵敏度分别为0.364和0.2764，均大于仪器方法要求的（全氮0.30，全磷0.16）。氮磷的试剂吸收分别为0.019和0.007，均小于仪器方法要求的（氮磷都为0.02）。氮全的带过% 分别为0.13%和0.37%，均小于仪器方法要求的（全氮0.5%，全磷1.2%）。

2.2 标准曲线的绘制结果

全氮全磷标准曲线绘制的方程分别为：y＝-0.0002x2+7.2793x+5.0447 和 y＝0.0014x2+15.0736x+18.7397。由图2可看出氮磷标曲线性良好，R2均为 1.0000，高于仪器的线性要求（N:0.9991，P:0.9999），表明AA3型连续流动分析仪可以快速且准确地测定氮磷混合标准系列浓度。全氮/全磷标准曲线的空白均高于原点（图2），这是为了使标曲溶液和样品成分一致，在标曲系列中加了消解的空白样的原因。

表1 CFA测定全氮/全磷方法的特性参数设置Table 1 The characteristic parameter for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.3 方法精密度测试结果

用CFA分别测定5种不同全氮/磷浓度梯度的待测液，重复测定10次，计算其平均值、标准偏差和变异系数 （见表2）。氮磷的标准偏差分别在0.017～0.038 mg/L 和 0.002～0.004 mg/L 范围内，满足仪器方法要求 （N:0.03 mg/L，P:0.0032 mg/L），全氮/全磷的变异系数（%）分别在0.276～0.776和0.552～0.919之间，均小于1%，表明具有较好的重现性。

表2 CFA测定全氮/全磷方法的重复性Table 2 Repeatability for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

表3 CFA测定全氮/全磷方法的最低检出限Table 3 The lowest detection limit for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

表4 CFA测定全氮/全磷方法的空白加标回收率Table 4 The blank spike recovery of determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.4 方法最低检出限的测试结果

根据EPA（美国环保协会）测定检出限的程序[17]，计算标准系列最高点浓度 （N:2mg/L，P:4 mg/L）*2%的浓度值 （N:0.2000 mg/L，P:0.08 mg/L）， 利用AA3连续流动分析仪重复测定该值10次 （如表3）。 10次平均值为 N:0.0097mg/L，P:0.0887 mg/L，标准偏差为N:0.0034，P:0.0032，相对标准偏差% 为N:1.6132%，P:2.9105%；检出限=标准偏差 *2.86，氮磷检出限分别为：N:0.0097mg/L，P:0.0092 mg/L，达到了仪器给出的方法检测极限（N:0.011mg/L，P:0.02 mg/L）。

2.5 空白加标回收率的测试结果

重复测量3次4个空白样的全氮/全磷浓度，用这4个空白样配置成空白加标待测液 （浓度为N:2、4、6、8 mg/L，P:2.5，3，3.5，4.0 mg/L）。 用AA3连续流动分析仪重复测量3次空白加标待测液的氮磷含量。空白加标回收是一种自控的质量控制试验，空白加标回收率结果如表4。由表可看出，全氮全磷的空白加标回收率分别在94.2%～100.5%和6.8%～100.5%之间。

表5 CFA测定全氮/全磷方法的相对准确度Table 5 Relative accuracy for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.6 方法准确度的测试结果

根据区域地球化学勘察样品分析方法[19]上对于方法准确度参数的测量与统计，称取国家标准物质（做3个平行样），和样品一起消解并重复测量3次其全氮/全磷浓度，与国家一级标准物质GBW07603（GSV-2）全氮/全磷认定值（N:15g/kg，P:1g/kg）比较，计算标品的平均值、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD）和相对准确度结果（如表5）。由表可知，经国家一级标准物质（GSV-2）验证，氮磷的测定结果与标准值吻合，全氮的方法相对准确度范围在99.22%～99.68%之间，全磷的方法相对准确度在99.76%～105.32%之间，表明具有较好的方法相对准确度。

3 讨论

本实验所用的CFA测定全氮/全磷方法两天可成功分析250个川滇高山栎样品，很好地提高了实验效率。当一次测量的样品＞100个样品，每个样品测2～3次，最终要测200～300次。为了使实验数据更加准确[5]，每30个样品最好插入一组漂移/基线校正杯。当然，仪器方法和实验数据的准确性是基于多种因素的，如样品的正确前处理、标准的准确性、仪器的稳定性、试剂的正确配置、试剂吸收和交叉污染等等，缺一不可，每一个细节都要注意。

消煮时要根据消煮液最后的颜色和澄清度，适当加温度或过氧化氢的用量。刚开始只能低温加热，微沸即可，爆沸会使样品溅得过高，样品损失，消煮难度也加大。建议一天最好只测一批样品(150个样品/3h)，清洗管路后再继续测第二批样时，虽省去仪器预热的时间，但因仪器工作时间过长，此时仪器的稳定性和泵管的弹性都不太理想，实验结果很多时候也不满足要求（如带过高，视图曲线不稳定等）。

标准样品必须含有与样品及样品清洗液同样的基体，使酸度基本一致，保证样品和标样的一致性。根据样品待测液酸度来调整试剂里需要添加的酸碱的量,全氮反应混合液（尾液）最终pH值要在12.8～13.1之间。全磷反应混合液最终显色酸度[H+]0.35～0.55 mol/L[20]。全磷试剂吸收很容易高，钼酸铵溶液配置中钼酸铵溶于酸中时的试剂吸收比溶于水中的要低[21]，但酒石酸锑钾不易溶于酸中，易溶于水，所以先将其溶于水中再混合，这样不仅省时间还能降低试剂吸收。

4 结论

对AA3型连续流动分析仪所附方法和文献报道的磷氮测定方法进行了具体改进后，用来测量川滇高山栎林枝叶样品待测液（硫酸-过氧化氢法消煮）中全氮/全磷含量。结果表明：CFA测定全氮/全磷方法的试剂吸收、灵敏度、带过%均满足仪器所附方法要求，基线稳定无杂峰，视图中峰形平滑且规律。全氮/全磷标准系列线性良好，相关系数达到了1.0000，高于仪器的线性要求；氮磷的标准偏差范围为 0.017～0.038 mg/L 和 0.002～0.004 mg/L，变异系数范围为 0.276～0.776%和0.552～0.919%，均小于1%（n＝10），具有较好的重现性；方法检出限分别为：N:0.0097mg/L P:0.0092 mg/L （n＝10），满足仪器所附要求；氮磷空白加标回收率范围在94.2%～100.5% 和 96.8%～100.5%之间（n＝3）；经国家一级标准物质（GSV-2）验证，氮磷测定值与标准值吻合，全氮的方法相对准确度范围在99.22%～99.68%之间，全磷的方法相对准确度在99.76%～105.32%之间（n＝3），具有较好的方法相对准确度。