2018年广西7种鸟类的新城疫病毒病原学监测和F基因遗传进化分析

曾婷婷 ， 谢丽基 ， 谢芝勋 ， 罗思思 ， 李 孟 ， 黄娇玲 ， 张民秀 ， 张艳芳 ， 范 晴 ， 邓显文

(广西壮族自治区兽医研究所 ， 广西 南宁 530001)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)可感染多种禽类，并引发以高致病性、高致死率为临床症状的新城疫(Newcastle disease，ND)，被世界动物卫生组织(OIE)列为规定的必须通报的烈性传染病之一，同时我国农业部也将其列为《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》优先防控的重大动物疫病之一。NDV可感染超过250种禽类和鸟类[1]，并且野鸟一直被认为是NDV的天然储存库，携带NDV的个体通过排泄物和分泌物使易感动物受到感染，成为家禽新城疫暴发的重要传染源[2]。因此，监测鸟类携带NDV的情况，了解NDV在鸟类当中的感染率和基因型分布，有利于家禽的ND防控。本实验室于2018年度对广西地区内的鹧鸪、山鸡、鹌鹑、珠颈斑鸠、斑鸠、野鸭和鸽子7种鸟类进行了NDV的病原分离鉴定并对它们的F基因进行遗传进化分析，为广西地区内的鸟类NDV的流行病学提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料 核酸抽提试剂盒EasyPure®Viral DNA/ RNA Kit、胶回收试剂盒EasyPure®Quick Gel Extraction Kit、载体连接试剂盒pEASY®-Blunt Simple Cloning Kit，均购自北京全式金生物技术有限公司；RT-PCR试剂盒PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit，购自宝日医生物技术有限公司。引物由深圳华大基因股份有限公司合成。标准阳性血清，购自哈尔滨维科生物技术有限公司。SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 样品采集 2018年在广西境内不同地区采集鹧鸪、山鸡、鹌鹑、珠颈斑鸠、斑鸠、野鸭和鸽子7种鸟类的咽喉/泄殖腔棉拭子样品共计904份，其中山鸡158份，鸽子257份，鹧鸪153份，珠颈斑鸠71份，斑鸠49份，鹌鹑214份，野鸭2份。其中山鸡、鸽子、鹌鹑为人工养殖鸟类，采集自活禽市场，鹧鸪、珠颈斑鸠、斑鸠和野鸭是野生鸟类，采集自广西野生动物救助中心。

1.3 病毒分离鉴定 将采集的鸟类咽喉和泄殖腔棉拭子，于含青链霉素的PBS中充分捻压，并于4 ℃冰箱中静置作用4 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清接种9～11日胚龄SPF鸡胚尿囊腔。鸡胚于37 ℃孵育并收集24～96 h内死亡或活胚的尿囊液。用血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)对尿囊液进行初步鉴定。

1.4F基因的RT-PCR扩增 设计4对引物扩增NDVF基因，FGENE 1和FGENE 2扩增产物拼接可得到CLASS Ⅰ NDVF基因全长，FGENE 3和FGENE 4扩增产物拼接可得到CLASS Ⅱ NDVF基因全长。引物信息见表1。参照试剂盒说明书对HI鉴定为NDV阳性的尿囊液提取病毒RNA，分别使用4对引物扩增NDVF基因。PCR产物回收后分别连接至pEASY®-Blunt载体，并转化克隆至大肠杆菌。阳性克隆送至深圳华大基因股份有限公司测序。

1.5F基因同源性及遗传进化分析 利用Lasergene软件拼接F基因并推导出NDV F0蛋白氨基酸序列，并对分离毒株与参考毒株序列进行同源性分析。利用MEGA 6软件对本试验分离毒株与参考毒株的F基因序列，进行遗传进化分析，采用Maximum likelihood test的Kimura 2-parameter模型，Bootstrap值设定为1 000构建系统遗传进化树。

2 结果

2.1 病毒的分离 2018年在广西境内采集7种鸟类的咽喉/泄殖腔棉拭子样品，其中山鸡、鸽子、鹌鹑为人工养殖鸟类，采集自活禽市场，由于饲养这些经济鸟类的养殖户规模大小不一，养殖水平参差不齐，故无法统计它们是否曾经接受过ND免疫。鹧鸪、珠颈斑鸠、斑鸠和野鸭是野生鸟类，采集自广西野生动物救助中心，未接受过ND免疫。采集鸟类拭子样品时眼观这些鸟类均为健康状态。共采集7种鸟类的咽喉和泄殖腔拭子904份，经过SPF鸡胚病毒分离和HI试验，结果共有17份尿囊液为NDV HI试验阳性，其中鸽源NDV 3份(3/257，1.16%)，山鸡源NDV 2份(2/158，1.26%)，鹌鹑源NDV 1份(1/214，0.46%)，鹧鸪源NDV 2份(2/153，1.30%)，斑鸠源NDV 5份(5/49，10.20%)，珠颈斑鸠源NDV 4份(4/71，5.6%)，野鸭未分离到NDV。将阳性尿囊液样品分别命名为GX1801+来源～GX1817+来源，如GX1801Turtle dove。

2.2F基因扩增和同源性分析 使用本试验设计的4对引物，对17份HI试验阳性尿囊液样品中的NDVF基因进行RT-PCR扩增并测序。RT-PCR结果显示，2株NDV出现CLASS Ⅰ NDV条带，15株NDV出现CLASS Ⅱ NDV条带(图1)。测序结果显示，F基因的开放阅读框全长均为1 662 nt，编码553个氨基酸。利用DNASTAR Megalign对这17个F基因和参考毒株比对分析，17个毒株之间的核苷酸相似性为71.1%～100%，其中GX1801Turtle dove、GX1802Pigeon和GX1806Partridge的F基因核苷酸相似性为100%，与LaSota的核苷酸相似性为71.1%～99.8%，与经典强毒F48E9的核苷酸相似性为71.5%～90.2%。根据F基因推导的氨基酸序列，F0蛋白裂解位点第112～117位的氨基酸序列，11株NDV的氨基酸序列为RRQKRF，符合NDV强毒分子特征。6株NDV的氨基酸序列为G/ER/KQG/ERL，符合NDV弱毒分子特征(表2)。

图1 17株NDV F基因RT-PCR扩增结果

表2 NDV F0蛋白裂解位点氨基酸序列和基因型

2.3F基因的遗传进化分析 采用F基因全长，与101个NDVF基因比对，构建进化树。结果显示，4株NDV(1株斑鸠源，1株鸽源，1株鹌鹑源，1株山鸡源)归属于CLASS Ⅱ基因Ⅰ型；2株NDV(1株鸽源，1株鹌鹑源)归属于CLASS Ⅰ基因1型；11株(4株斑鸠源，4株珠颈斑鸠源，1株鸽源，1株山鸡源，1株鹌鹑源)归属于CLASS Ⅱ基因Ⅵ型。根据He等[3]和Dimitrov等[4]对CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV的分类方法和参考序列，与本文的11株CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV构建的进化树发现，GX1812Pigeon属于Ⅵj亚型，其余10株属于Ⅵk亚型(图2)。

3 讨论

一直以来，野鸟都被认为是NDV的天然储存库，所以野鸟携带NDV的情况也备受关注。根据之前的流行病学报道，2005—2006年，李东伟[5]对黑龙江部分地区的野鸟携带NDV的调查结果为14份其中13份为CLASS Ⅱ基因Ⅶ型，1份为CLASS Ⅱ基因Ⅲ型。2012年李凤勇[6]对向海地区的野鸟携带NDV调查发现22份NDV均属CLASS Ⅰ。同年，张渭东[7]对秦岭的野鸟进行NDV流行病学调查发现，5份阳性样品均为CLASS Ⅱ基因Ⅵb型NDV，与当时流行的鸽源NDV属同一分支。2014年，李胜楠等[8]从湖南长沙、吉林省莫莫格保护区以及河北沧州等地分离到的7株野鸟源NDV，5株为CLASS Ⅱ基因Ⅰ型，2株为CLASS Ⅱ基因Ⅱ型。同年，李小阳[9]从湖南洞庭湖、吉林莫莫格国家级自然保护区和吉林东北虎园分离到了17株野鸟源NDV,其中10株为CLASS Ⅱ基因Ⅰ型，7株为CLASS Ⅱ基因Ⅱ型。由此可见，CLASS Ⅱ基因Ⅰ型和CLASS Ⅰ NDV是长期在野鸟中存在的，本实验室也在斑鸠中分离到CLASS Ⅱ基因Ⅰ型1株。同时，在养殖鸟类鸽子、山鸡和鹌鹑也分离到了CLASS Ⅱ基因Ⅰ型和CLASS Ⅰ NDV。

然而，从斑鸠、珠颈斑鸠、鸽子、山鸡和鹌鹑均分离到了分子特征为强毒特征的CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV，且比例很高(11/17)，尤其值得关注。提示鸟类可以感染携带强毒NDV而不发病。斑鸠和珠颈斑鸠不是候鸟，广西的土鸡养殖模式是山林，果林散养为主，鸭、鹅养殖模式是水塘散养为主，因此这2种鸟类的生活区域可能与禽类养殖地区长期重叠，携带强毒NDV与养殖禽类长期接触。尽管目前仍然没有鸡、鸭、鹅感染CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV发病的报道，然而经过长期接触，CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV会不会对这些禽类产生致病引起ND暴发，仍然未知，需要密切跟踪关注。鸽子、山鸡和鹌鹑为人工养殖鸟类，检测出CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV是在养殖过程中感染携带，还是在活禽交易市场中感染携带，则需要更多的溯源采样证实。

CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV自20世纪70—80年代被发现以来[10-11]，一直在不断的流行演化。起初，鸽源NDV属于基因Ⅵb亚型[12]，Xue等[13]在2015年吉林省的鸽子中分离到了Ⅵk亚型NDV。He等[3]对广西2012—2018年的ND发病鸽群进行病原分离和NDV进化分析，发现5株NDV属于Ⅵj亚型，13株属于Ⅵk亚型。对本次病原学监测获得的11株CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV进行遗传进化分析，其中10株属于Ⅵk亚型，1株属于Ⅵj亚型，并且在进化关系上与广西的鸽源NDV非常靠近。与本试验10株Ⅵk亚型NDV Blast结果最接近的广东苍鹭分离株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015[14]经遗传进化分析，也属于Ⅵk亚型；同一研究中的另外3株野鸟NDV分离株均与鸽源NDV亲缘关系接近。说明这些鸟类和养殖鸽群一直存在着NDV互相传播的现象，但是到底这些新的基因亚型是在野鸟体内进化得来传播到鸽子还是在鸽子体内进化得来传播到野鸟，未来这些基因亚型的致病性将如何发展，仍然未知。本实验室下一步也会对这些毒株进行致病性试验和全基因组测序，同时也将对之前的病原学监测获得的毒株[15]进行回顾性研究，以期对广西地区的鸟类NDV有深入的理解。