鸡传染性贫血病毒湖北分离株XH16全基因组序列分析

靳泽华 , 黄 英 , 王泽宇 , 张安定,4

(1. 华中农业大学动物医学院 农业微生物学国家重点实验室 ， 湖北 武汉 430070 ； 2. 湖北省预防兽医学重点实验室 生猪健康养殖协同创新中心 ， 湖北 武汉 430070 ； 3. 农业农村部兽医诊断制剂创制重点实验室 ， 湖北 武汉 430070 ； 4. 科技部动物疫病联合研究中心 ， 湖北 武汉 430070)

鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CAV) 是圆环病毒科、环病毒属、单股环状DNA病毒，对各年龄鸡均易感，感染后可引起鸡只贫血，并伴有淋巴组织萎缩，导致免疫抑制，严重危害了家禽养殖业[1]。2016年，湖北某家禽养殖场发生了疑似鸡传染性贫血病毒感染，该场5周龄肉鸡黏膜苍白，出现贫血症状，生长发育停滞。本实验室从病鸡肝脏中分离到1株病毒并将其命名为CAV-XH16。本试验旨在分析鸡传染性贫血病毒分离株CAV-XH16的基因组特征，为鸡传染性贫血病毒分子流行病学研究和新型疫苗研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料 被检样品来自于湖北某鸡场的1只疑似鸡传染性贫血病毒感染的肉鸡，该鸡鸡冠及黏膜苍白，精神萎靡，生长发育迟缓。剖检采集其肝脏匀浆保存备用。

1.2 主要材料TransTaq®-T DNA Polymerase，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA Ladder，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物合成 参照GB NY/T 1187-2006鸡传染性贫血病毒聚合酶链反应试验方法，合成鸡传染性贫血病毒PCR鉴定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R；基因组测序引物参照文献[2]设计。引物序列如表1所示，所有引物序列均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.4 实验动物 SPF鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，并孵化成鸡。

1.5 病毒PCR检测 取病鸡肝脏加入PBS充分研磨后，将研磨液反复冻融3次，12 000 g离心10 min， 取300 μL上清,加入1 mL苯酚氯仿异戊醇(25∶24∶1)抽提DNA，8 000 g离心5 min;取上层水相并加入2倍体积的异丙醇沉淀DNA,15 000 g离心5 min;弃上清，加入1 mL 70%乙醇,12 000 g离心5 min；弃上清，室温干燥5 min后，加入50 μL超纯水溶解DNA。取2 μL溶解的DNA作为模板，使用鉴定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R进行扩增，并将扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，并将琼脂糖凝胶电泳分离得到的条带送北京擎科生物科技有限公司测序，比对测序结果。

1.6 动物回归试验 将80只SPF鸡随机分为2组，试验组50只，对照组30只。将1.5中所得的病鸡肝脏研磨液反复冻融3次，12 000 g离心10 min，取上清。将上清用0.22 μm滤器过滤去除杂质。试验组取100 μL过滤后的上清腹腔接种1日龄SPF鸡。对照组腹腔接种100 μL PBS。接种后持续观察鸡只的精神状况、发病和病死情况。在接种第21天时，分别剖检试验组和对照组鸡只，取出肝脏研磨，参照1.5中方法进行PCR鉴定病毒。

1.7 组织病理学检查 将10只1日龄SPF鸡随机分为2组，包括试验组和对照组，每组5只，参照1.6中接种方法，试验组接种过滤后的上清，对照组接种PBS。接种第8天时将鸡处死，进行剖检，并分离每只鸡的胸腺、骨髓、法氏囊、肝、脾等组织器官，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片并用苏木精和伊红染色，封片后，显微镜下观察并记录病理变化。

1.8 全基因组序列测定及分析 以分离株的基因组为模板，分别用引物CAV-F1/CAV-R1、CAV-F2/CAV-R2和CAV-F3/CAV-R3扩增，将扩增得到的片段送北京擎科生物科技有限公司测序，并将测序结果运用MEGA 7.0、Snapgene 2.5等软件进行拼接得到分离株的全基因组序列，并与GenBank上参考序列进行比对和分析。

1.9 遗传进化分析 基于分离株的全基因组序列和VP1、VP2和VP3蛋白质序列与GenBank上参考序列进行比对和分析。运用MEGA 7.0软件，采用Kimura双参数模型和1 000个自展值的邻近方法进行系统进化分析。

2 结果

2.1 病毒的PCR检测 以病鸡肝脏研磨液提取的基因组为模板，用鉴定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R进行PCR，并将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见与预期符合的676 bp的条带(图1A)，将该条带进行测序，分析测序所得序列，结果表明，分离序列与GenBank上CAV参考序列相似性最高，表明分离株为鸡传染性贫血病毒，将其命名为CAV-XH16。

2.2 动物回归试验 将分离株CAV-XH16接种1日龄鸡，检测其致病性。回归试验结果显示，试验组约50%的鸡只在感染后7～16 d出现明显贫血表现，且有精神沉郁、厌食等症状，在此期间共有26只鸡死亡。随后，试验组其他鸡只状态逐渐恢复。对照组鸡只没有明显的临床症状。分别取试验组病死鸡只和对照组鸡只的肝脏研磨液，提取基因组作为模板用鉴定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R进行PCR，并将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见676 bp的条带(图1B)，表明试验组可鉴定到鸡传染性贫血病毒。

图1 PCR检测结果

2.3 CAV-XH16对雏鸡组织脏器的影响 将试验组和对照组的5只鸡在接种第8天时处死，进行剖检和病理组织学检查。剖检发现，与对照组比较，试验组鸡只骨髓苍白，胸腺、法氏囊萎缩，肝脏肿大。与对照组相比，试验组鸡只的组织切片发生明显改变，主要表现有：胸腺有出血，皮质的淋巴细胞严重减少，髓质和皮质之间的界限缩小，胸腺中也可见大的淋巴母细胞、核巨化，网状细胞空泡化、呈星状(见封二彩版图2A、2B)；骨髓造血干细胞极少，淋巴细胞、巨噬细胞和粒细胞明显减少，被脂肪组织取代(见封二彩版图2C、2D)；法氏囊萎缩，淋巴滤泡变小且数量减少，伴随巨噬细胞和浆细胞浸润(见封二彩版图2E、2F)；肝内可见肝细胞和肝窦内皮细胞的变形和肿胀，肝窦内可见大量脂肪空泡，红细胞减少(见封二彩版图2G、2H)；脾内网状细胞增多，淋巴细胞和红细胞减少，脾红髓和白髓边界不清(见封二彩版图2I、2J)。

2.4 CAV-XH16全基因组序列测定及分析 以分离株CAV-XH16基因组为模板，分别用引物CAV-F1/CAV-R1、CAV-F2/CAV-R2和CAV-F3/CAV-R3扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到了与预期符合的842 bp、990 bp、802 bp的片段。回收各个片段后测序、拼接得到分离株CAV-XH16全基因组的序列。CAV-XH16全基因组序列已提交NCBI,登录号为MK770259。分析CAV-XH16氨基酸序列，结果显示，CAV-XH16 的VP1氨基酸序列含有139K和144E、75V、89T、125L、141Q、144E、394Q；VP2氨基酸序列含有95C、97C、101R、102K、86E、101R、103H、129R、131Q、150R/151K/152K、161D/162E、186E、163L和169D。VP1中第394位残基是毒力的主要决定位点，394Q和394H分别代表高致病性和低致病性，CAV-XH16第394位残基为Q，表明CAV-XH16具有高毒力特征。

2.5 CAV-XH16遗传进化分析 鸡传染性贫血病毒可分为5个基因型(A～E)，11个基因亚型(A1～6,D1～2和E1～3)[3]。对CAV-XH16全基因组进行遗传进化分析，结果表明，CAV-XH16属于A1亚群，是亚洲CAV分离株所属的主要亚群，与中国分离株JL14023(NCBI登记号KY486145)有99.65%的相似性(图3)。鸡传染性贫血病毒编码的3种蛋白中，VP1表现出高度的多样性。CAV-XH16的VP1与属于同一A1亚群的VP1具有高度相似性。CAV-XH16的VP1氨基酸序列进化分析表明，基于病毒VP1序列构建的遗传进化树与基于全基因组构建的遗传进化树较为相似(图4)。CAV-XH16的VP2和VP3氨基酸序列进化分析表明，这2种蛋白在不同的鸡传染性贫血病毒中高度相似，表明鸡传染性贫血病毒基因变异可能主要是由VP1基因变异引起的。

图3 CAV-XH16全基因组序列遗传进化分析

图4 VP1蛋白氨基酸序列遗传进化分析

3 讨论

鸡传染性贫血病毒于1979年首次在日本分离得到，可在鸡群之间传播并引起严重贫血。鸡传染性贫血病毒主要有3个重叠的开放阅读框组成，分别编码VP1、VP2和VP3蛋白[4]。

鸡传染性贫血病毒VP1蛋白是主要的结构蛋白，可诱导产生中和抗体，C端第2、13、14、21、22位等的氨基酸变异性极高，但N端第1～19位氨基酸相对保守，富含精氨酸，可使蛋白具有高效的细胞穿透活性，从而使病毒具有更广泛的细胞嗜性[5]。Renshaw等报道，第139～151位氨基酸是VP1蛋白的高度变异区，第139位和第144位氨基酸决定了病毒的增殖速度和传播效力，第139位氨基酸由K变异为Q和/或第144位由E、D、N变异为Q会降低病毒对鸡的感染力。CAV-XH16 的VP1蛋白第139位为K，第144位为E，表明该毒株对鸡有较高的感染力。另有研究表明，如果VP1蛋白的第75、89、125、141位和第144位氨基酸同时发生变异，CAV不会导致贫血、白骨髓及胸腺萎缩[6]。CAV-XH16的VP1蛋白含有75V、89T、125L、141Q和144E，表明该病毒具有高毒力的特征。更重要的是，VP1蛋白的第394位氨基酸是毒力的主要遗传决定因素，谷氨酰胺(Q)和组氨酸(H)分别代表高致病性和低致病性[7]，CAV-XH16的VP1蛋白在该处为Q，表明该病毒的VP1具有高毒力的分子特征。因此，对CAV-XH16的VP1蛋白序列分析结果表明，CAV-XH16具有VP1中所有已知的高毒力分子特征。

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白是一种具有双重特异性磷酸酶(DSP)活性的复制酶,可能在CAV装配过程中作为支架蛋白，确保VP1能够正确折叠。VP2第95、97位的半胱氨酸发生突变可显著降低病毒增殖速率并减弱对感染细胞的致病性，因此，VP2第95、97位的半胱氨酸是CAV毒力所必需的[8]。有文献报道，VP2第102位的氨基酸由K变异为D，会显著降低病毒的复制效率，第101位的氨基酸由R变异为G，会减弱病毒对细胞的致病性，但不会影响病毒的复制效率[9]。CAV-XH16的VP2第95、97、101位和第102位依次为C、C、R、K，这表明CAV-XH16对细胞具有较强的致病性。另有文献报道，VP2中发生C86R、R101G、H103Y、R129G、Q131P、R150G、K151A、K152A、D161G、E162G和E186G等突变时会高度减弱毒株毒力，发生L163P和D169G突变会相对减弱毒株毒力[10]。CAV-XH16的VP2含有101R、103H、129R、131Q、150R、151K、152K、161D、162E、186E、163L和169D，表明CAV-XH16的VP2含有高毒力的分子特征。

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白也被称为凋亡蛋白，通过独立于p53的机制，在癌细胞中特异性地诱导细胞周期(细胞分裂后期/分裂期)阻滞和凋亡[11]。有文献报道，VP3对于CAV DNA的复制和组装是不可或缺的[12]。进化分析表明，VP3是最保守的蛋白。VP3的保守性保证了其在CAV生命周期中稳定的发挥功能。

本试验从湖北某鸡场分离得到1株鸡传染性贫血病毒，并对其进行了全基因组序列分析及VP1、VP2、VP3氨基酸序列分析。序列分析结果表明，该毒株是1株高毒力毒株。全基因组遗传进化分析结果表明，该毒株属于A1亚群，是亚洲CAV分离株所属的主要亚群，与中国近期分离株具有高度的相似性，与中国分离株JL14023(NCBI登记号KY486145)有99.65%的相似性，CAV-XH16可作为中国最新流行株的代表，用于鸡传染性贫血病毒疫苗的研制。