管碟法测定血清青霉素浓度的影响因素分析及实验教学应用

王见之

（复旦大学基础医学国家级实验教学示范中心，上海200032）

0 引 言

我校微生物实验教学涵盖多种微生物基础实验，例如细菌的染色检查、人工培养、生化反应、药物的抗菌作用、细菌性疾病的微生物学诊断、病毒学实验方法、分子微生物学实验方法等教学实验［1］。该课程主要目的在于加深学生对医学微生物学基础理论知识的理解、掌握必要的技能、培养科学严谨的态度、训练观察和记录实验结果及整理分析实验结论的能力。其中，细菌人工培养、药敏试验是基础医学乃至临床医学常用的实验技术。但是目前两种实验在教学中仍有不足，可以通过改良进一步提高教学质量和学生投身科研实验的兴趣。

目前，我校微生物实验教学中针对细菌的人工培养、药敏试验主要有以下课程安排：细菌在液体培养基中扩增在教学课程前由教师完成，学生在课堂上只需要划线接种即可，然而细菌的人工培养从培养基的配制、细菌的接种、培养性状的观察都需要学生掌握。细菌药敏试验，即抗生素的抑菌试验，是广泛应用的实验技术，应当为广大医学生所掌握，但是由于目前采用的药敏试验——纸片扩散法的教学方案虽然难度较小，但是实验影响因素较多，难以获得理想的培养结果，容易出现假阳性、假阴性结果，药敏试验结果可信度低，也打击了学生进行实验活动的积极性。

微生物管碟法是测定抗生素血药浓度的常用方法。目前，管碟法可用于检测商品药物效价［2］、提取物抑菌试验［3-4］、菌种抗性监测及选育等［5-6］。利用管碟法测定血药浓度的准确性受多种因素影响［7-8］，本研究针对管碟法各个步骤中的常见影响因素，利用临床上常用药物青霉素作为测定对象进行分析，从而建立一种完善可靠的微生物测定法。本实验探索简单易行的细菌培养方法，在短时间教学过程中让同学们掌握各种细菌人工培养的方法、练习多种接种方式、学会观察培养性状及实际应用等。

1 主要试剂与仪器

注射用青霉素钠（生产批号F5092312）购自华北制药股份有限公司；藤黄微球菌（ATCC9341）、抗生素检定培养基Ⅱ号购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；LB培养基、玻璃培养皿（高度约16～17 mm，直径90 mm）、牛津杯（规格10 mm×8 mm×6 mm）、分光光度计（上海光谱仪器有限公司）由复旦大学基础医学院医学实验教学中心提供。

2 实验方法

2.1 实验环境和实验材料的准备

实验操作台需要洁净无抗生素污染，紫外消毒。所有的实验器材均需灭菌处理。培养皿、牛津杯均为厚薄、大小、重量一致的标准产品。及时做好实验菌种的传代和定期检查工作，发现菌种老化需及时进行纯化、复壮。

2.2 待检样品制备

清洁级健康青年Sprague-Dawley大鼠（250±50 g，3月龄）8只和老年SD 大鼠（600±50 g，18月龄）8只，购自复旦大学实验动物科学部。腹腔注射青霉素（1万U／100 g体重）60 min后尾静脉采血，于4℃冰箱静置1 h，离心（3 000 r／min，10 min）取上清，放入-80℃冰箱保存待用。

2.3 管碟法基本操作步骤

依据《中华人民共和国药典（2010年版）》管碟法测定［9］，选择藤黄微球菌（ATCC9341）为质控菌种，扩增后存入4℃冰箱保存待用。取玻璃平底培养皿，无菌条件下倒平板，底层为20 mL抗生素检定培养基Ⅱ号，菌层5 mL，四象限法放置牛津杯，杯内加入血清样品。另配置青霉素标准液用于制作标准曲线。27℃环境下培养后测量抑菌圈的直径，其中最大浓度青霉素标准液产生的抑菌圈直径应处在18～22 mm之间。由于抗生素浓度的对数值在一定范围内与其产生的抑菌圈直径成正比，因此可根据直线拟合所得青霉素的标准曲线计算血清中的青霉素浓度［10］。

3 实验结果及影响因素分析

3.1 青霉素标准液的配制

精确称取注射用青霉素钠，利用pH＝7.8的磷酸盐缓冲液溶解、稀释、校正后，配制浓度分别为102～106U／L的青霉素标准液。本实验中测定对象是青、老年大鼠，体重介于200～700 g之间，而腹腔注射青霉素剂量为1万U／100 g体重，血清青霉素浓度围绕103～104数量级之间，同时有研究发现［11］，标准品溶液的配制是抑菌试验不确定度的主要来源，因此设计青霉素标准液浓度范围十分关键，这关系到回归方程线性范围的准确性。

3.2 细菌悬液的制备

取藤黄微球菌的营养琼脂斜面培养物划线接种于营养琼脂板上，27℃培养16～20 h，挑选2代单克隆菌种接种于LB培养基内，在27℃环境下摇床培养。实验发现，当藤黄微球菌悬液扩增至OD600＞0.5时，培养时间适中且抑菌圈直径大小较易测量，符合质控菌种的要求。细菌的浓度应当达到数量要求，否则后续培养时间会过长，抑菌环超出最佳数值范围。

3.3 双碟培养基的制备

（1）底层培养基。121℃，30 min高压灭菌后的培养基，加注底层20 mL，均匀铺满平皿且无气泡，温度不应过低，控制在60～70℃，以免培养基在倒板过程中凝结成块而无法使用。待凝固后进行下一步。

（2）菌层培养基。无菌条件下用微量移液器吸取细菌悬液适量，加入融化的抗生素检定培养基Ⅱ号中，制成5 mL菌层。培养后对最大浓度标准液（106U／L）产生的抑菌圈直径进行测量。结果显示，菌液和培养基体积之比为1∶50时，抑菌圈最大直径处在20 mm左右。菌层制备过程中培养基温度会影响菌层的均匀摊布，有研究证实［8］，温度过低培养基会提前凝固。室温25℃左右时制备菌层，培养基温度需要满足以下两个条件：①融化的培养基温度不可超过50℃，过高可使细菌生长受限甚至导致细菌死亡而无抑菌圈；②不可低于45℃，过低导致菌液与培养基不能混匀，在培养基在底层上摊布不均匀，表面部分凝固、局部凹凸不平，产生的抑菌圈不规则，误差增大。所以当菌液加入培养基混匀以后，应当尽快加注到底层培养基上并迅速转动培养皿使菌层培养基均匀铺满整个底层培养基，若表面不平整则会导致样本从牛津杯下缘流出导致实验失败。

3.4 加样的影响因素

尽量使用自动放置器按照四象限法放置牛津杯，以使牛津杯之间的距离均等，避免距离过小导致抑菌圈相连。放置好的牛津杯应静置15 min使其在培养基上沉降稳定，再用微量移液器向牛津杯中加样。加样量为20 μL时，可以得到直径大小较为适中的抑菌圈，且不会出现牛津杯因为加样量过多产生位移或者样品从牛津杯渗出导致抑菌圈模糊的现象。由于不同的样本中抗生素浓度不一致，加样量大抑菌圈大，加样量小抑菌圈小，所以加样量的多少主要取决于每个牛津杯中抗生素单位数，不同的待检样本需通过预实验来确定合适的加样量。加样过程中，移液器枪头吸液不能有气泡，样本需一次加样成功，滴加时注意加样方向以及高度，不能挂壁或者漏到牛津杯外缘，最大加样量不应超出牛津杯体积范围，操作不规范均会导致实验失败。

3.5 双碟培养时间及温度对样品检定的影响

检测不同培养时间对抑菌圈产生效果的影响，发现当27℃培养6～12 h时，抑菌圈清晰且最大直径处于20 mm左右。如果培养时间过长，抑菌圈会出现边界不清、抑菌圈相连难以精确测量的情况。培养时间过短，则菌层还未生长到可观察的状态，细菌抑制效果不明显。培养时间及温度的确定跟菌层中菌量多少、抗生素效价有关，所以在每次实验前都需要预实验来确定具体方案，并在培养过程中进行观察，在适宜时间进行结果测定。

3.6 抑菌圈测量的影响因素

主要有游标卡尺测量和抑菌圈测定仪测量两种方法。一般选用仪器测量以减小人为因素造成的误差。记录测量结果后进行药物浓度计算和统计分析。

3.7 标准曲线与应用

根据已经确定的实验条件按步骤操作，测得青霉素标准液产生的抑菌圈直径。以样品中青霉素浓度c（U／L）的对数为纵坐标，抑菌圈直径d（mm）为横坐标，绘制标准曲线。利用Microsoft Excel软件计算回归方程为lg c（U／L）＝0.10 d（mm）＋2.66，R2＝0.996，该方程的线性范围为102～106U／L。利用已知条件进行大鼠血清样品测定，可得到边界清晰、大小适中的抑菌圈。测得青年大鼠血清青霉素浓度为（4 957.93 ±526.32）U／L，老年大鼠为（41 835.98 ±633.69）U／L（见图1）。

图1 青老年大鼠血清样品中青霉素浓度的测定结果

4 教学实践

细菌的人工培养和药敏试验是需要学生掌握的实验技术。教学过程中发现，以往我校开展的实验课由于经济、师资、时间和空间成本的原因，预实验通常只由实验教师完成，课堂上同学只需划线接种，学习纸片扩散法药敏实验，实验结果不够精确。本研究讨论的管碟法是国际常用的抗生素微生物检定法之一，针对管碟法中可能影响实验结果的条件进行探讨，总结出了一种完善可靠的实验条件，并运用于教学实验中。基于以上实验条件，选拔一批对科研有兴趣、学有余力的同学［12］，由实验教师带领进行了如下预实验准备：样本的制备，青霉素标准液的配制、实验器材的灭菌、细菌的培养，双碟的制备及标准曲线的制作。实验开始前，教师对细菌培养的原理以及样本制作、管碟法的步骤做了介绍，详细讲解了实验影响因素以及实验过程中的注意事项。而实验中以教师指导、学生自主操作为主要教学方法。过程中指导学生进行结果分析，引导学生查询资料，建立不同的疾病模型获取实验样本、分析实验结果中出现的各种问题的原因［13-14］。经过实验准备、实验操作、结果分析、资料查询、实验报告撰写等使学生得到系统的锻炼，如动物手术操作训练、动物疾病模型的建立方法、仪器设备的使用以及细菌人工培养方法、抗生素的测定方法等，增强了学生生物安全以及动物伦理知识（见表1）。综合以上同学的实验结果来看，此实验方案可行，整个操作过程规范，多组别的样本制作、标准曲线可用，测得不同组别的样本有差异性。

表1 管碟法应用于教学实践后的学习效果

5 结 语

传统微生物实验教学中细菌人工培养多采用固体培养基培养，教师准备好菌群供学生接种，学生不能完全掌握细菌人工培养的各种方法，细菌的药敏试验又是医学研究中广泛应用的实验技术，应当为广大医学生所掌握。本研究建立了一种较为完善可靠的利用微生物管碟法测定血清青霉素的方法，运用于教学实验中，并致力于提高教学水平，在基础实验教学中培养学生的创新能力。由于实验准备周期长，目前只能让部分学有余力，乐于参与预实验的同学受益，取得较好的教学效果。未来借鉴MOOC等先进教学理念［12，15］，将信息化时代的线上教学和传统实验的线下教学有机结合，全面覆盖到教学实验中，提高教学水平及效果。