蛋白质免疫印迹技术在本科实验教学中的应用

李 欣， 赵玉红， 石建党， 赵立青， 李小菊， 张伟英

（南开大学生命科学学院生物国家级实验教学示范中心，天津300071）

0 引 言

蛋白质免疫印迹（Westernblotting或Immunoblotting）技术是通过免疫学手段，即利用抗原抗体特异性结合来检测固定在支撑膜上的蛋白质，从而对靶蛋白进行定性和半定量分析的一项重要实验技术［1-2］。该技术将电泳的高分辨率和免疫反应的高特异性结合在一起，有利于在复杂样品中对靶蛋白进行检测和鉴别，进而获得相应细胞或组织中靶蛋白的表达水平等相关信息，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学等诸多研究领域中常用的实验方法［3-4］。

基于蛋白质免疫印迹技术的重要性和实用性，我校生物实验教学中心分子生物学课程组积极尝试将其引入本科实验教学，设置了“免疫印迹法检测目的基因在原核细胞中的表达”这一综合性实验。该实验首先利用SDS-PAGE将菌体样品中的蛋白分离，再经过电泳转印将蛋白转移至固相支撑膜上，通过抗体杂交特异性的检测菌体中目的蛋白的表达情况。该实验的设置旨在让学生能够紧跟学科发展，充分理解并掌握免疫印迹法这一科研领域常用技术手段，并在教学实践中培养学生严谨的科学思维和良好的科学素养，以便更好地与未来发展接轨［5-6］。

1 主要实验仪器

Bio-Rad垂直电泳装置，Bio-Rad Mini Trans-Blot转印槽，Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干转印槽，Bio-Rad PowerPac HC高电流电泳仪，Eppendorf 5418离心机，金属浴，恒温振荡培养箱，GeneSys Chemi：XR5凝胶成像系统，磁力搅拌器，摇床等。

2 主要实验材料与试剂

分别转化有pGEX-4T-2和pGEX-4T-2／GAPDH质粒的大肠杆菌DH5α，30%丙烯酰胺凝胶贮液，分离胶缓冲液（1.5 mol／L Tris-HCl，pH8.8），浓缩胶缓冲液（0.5 mol／L Tris-HCl，pH6.8），10%SDS，10%AP，TEMED，1×电极缓冲液，2×SDS-PAGE上样缓冲液，预染Marker，1×PBS溶液，电转移缓冲液（湿转／半干转），100%甲醇，PVDF 膜，Whatman 3MM 滤纸，PBST，封闭液（5%脱脂奶粉），鼠源抗GST抗体，辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）偶联羊抗鼠IgG，ECL化学发光试剂盒等。

3 实验方法

3.1 大肠杆菌的诱导培养

（1）菌种培养。将含pGEX-4T-2空载体和pGEX-4T-2／GAPDH重组质粒的大肠杆菌DH5α分别接种于10 mL含有80 μg／mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200 r／min 振荡培养。

（2）诱导培养。至OD600达0.4～0.6 时，分装菌液至细菌培养管中，每管4 mL，两种菌液各分2管，其中1管作为对照，不加IPTG诱导，另外1管加入IPTG至终浓度1 mol／L，20 ℃，200 r／min 振荡培养过夜。

3.2 样品的制备

（1）收集菌体。在1.5 mL离心管中加入100 μL菌液，12 000 r／min 离心1 min，弃去上清，4 份菌液样品收集方法相同。

（2）菌体裂解。在4份菌体沉淀中分别加入100 μL PBS溶液，充分混匀后再加入等量2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后金属浴上100℃加热20 min，并且每隔几min轻弹盛装样品的离心管底部，保证菌体裂解充分。

（3）获得上样样品。菌体裂解液14 000 r／min离心5 min，上清用于上样。

3.3 SDS-PAGE

（1）制胶。配制12%分离胶和5%浓缩胶。

（2）上样。预染Marker 3 μL，样品8 μL。

（3）电泳。样品在浓缩胶时电压80 V，在分离胶时120 V。

3.4 电泳转印

（1）根据Marker条带将凝胶切成理想大小，剪好同等大小的滤纸和PVDF膜。

（2）将PVDF膜放入100%甲醇中浸泡1～2 min。

（3）将凝胶、滤纸和PVDF膜放入电转移缓冲液中平衡。

（4）在Bio-Rad Mini Trans-Blot转印槽或Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干转印槽中组装“三明治”结构，转印槽连接电泳仪，前者4℃ 100 V恒压转印1 h，后者10 V转印30 min。

3.5 抗体杂交

（1）将PVDF膜置于封闭液中，室温封闭45 min，PBST洗膜。

（2）孵育鼠源抗GST抗体（1∶5 000 PBST稀释），室温孵育1 h，PBST洗膜。

（3）孵育HRP偶联羊抗鼠IgG（1∶10 000 PBST稀释），室温孵育45 min，PBST洗膜。

3.6 成像检测

（1）将ECL化学发光试剂盒中的A液和B液1∶1配制，PVDF膜上孵育1 min后弃去。

（2）将PVDF膜放入凝胶成像系统，CCD成像。

4 实验结果

图1、2所示是用鼠源抗GST抗体对4份菌体样品中的GST（大小约26 kD）和GST-GAPDH（大小约63 kD）蛋白进行Western Blotting检测，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。其中图1是经CCD成像的直观结果，图2是利用软件将发光条带与Marker合成后的结果。

从图2结果可见，A和B泳道上出现GST相应大小的清晰条带，C和D泳道上出现GST-GAPDH相应大小的清晰条带，且诱导组（B和D）分别较对照组（A和C）中目的蛋白表达量有明显增加，符合实验预期。但结果中尚存在2个问题：①出现非特异性条带；②没有检测内参（这两部分内容会在后面的5.4和6.3.4中具体讨论）。

图1 CCD成像结果

图2 软件合成结果

5 注意事项

5.1 预染Marker的使用

在Western blotting的SDS-PAGE中，所用的Marker为条带可见的预染Marker，其作用是不需要经过染色就可以实时观察电泳进度和Marker条带的分离情况。在后续的实验步骤中，它是作为估测转印效率以及确定最终蛋白条带大小的重要依据。

5.2 “三明治”结构的组装

所谓“三明治”结构，是指在湿转和半干转操作过程中形成的“（负极）滤纸—凝胶—膜—滤纸（正极）”结构。正确组装“三明治”结构是将凝胶中的蛋白成功转印于支撑膜上的关键步骤，也是检验学生对电泳转印原理掌握情况的重要标准。组装三明治结构时方向切勿装反，并且需要赶走气泡，保证三明治结构中各层完全贴合，防止气泡干扰转印。

5.3 转印条件的确定

转印的电压和时间与目的蛋白的大小、所使用的转印方法等因素密切相关。当转印分子量较大的蛋白时，通常采用湿转，同时可以适当提高电压或延长转印时间；对于小分子量蛋白，湿转和半干转均可，但切忌电压过高或转印时间过长，否则小蛋白容易穿透支撑膜而不能有效转印。在转印条件相同的情况下，电压和时间呈负相关，如需要延长转印时间，则可以适当降低电压［7-8］。具体转印条件需要根据不同实验内容而定。

5.4 杂交中非特异性结合的降低

本实验结果中可见非特异性条带，为尽可能地降低或避免非特异性结合，通常有以下几个方面需要注意：11抗体孵育时间不宜过长，尤其是二抗，抗体孵育时间越长，则需要增加洗膜次数；22抗体孵育后的漂洗需要在摇床上快速摇动并多次换液，通常以少量多次的洗膜方式效果更好［9］；33延长封闭时间，还可以在封闭液中加入吐温20。当然，抗体本身的质量好坏以及稀释倍数的高低对于杂交特异性的影响更是至关重要，需要在实践中不断摸索和尝试。

6 教学实践

6.1 基础实验

分子生物学实验是面向本院生物科学、生物技术和伯苓班专业大三学生开设的基础性实验必修课程，教学内容围绕“小鼠GAPDH基因的克隆与原核表达”而展开，10项实验项目分别为：从小鼠肝脏中提取RNA，RT-PCR获得目的基因，目的基因的纯化与回收，载体pGEX-4T-2的制备，目的基因／载体的酶切，酶切片段的回收，目的基因与载体的连接，转化，转化子的筛选（菌落PCR），目的蛋白的诱导表达和PAGE分析。

由此可见，基础实验教学在教学内容上环环相扣，即上一实验的产物是下一实验的材料。整个实验是从提取小鼠肝脏RNA开始，逐步构建重组DNA分子pGEX-4T-2／GAPDH，并最终通过IPTG诱导获得原核表达。

在目的蛋白的诱导表达和PAGE分析实验中，分别对转化有pGEX-4T-2空载体和pGEX-4T-2／GAPDH重组质粒的菌体进行IPTG诱导，全菌样品利用SDSPAGE结合考马斯亮蓝染色分析，结果如图3所示。

图3 考马斯亮蓝染色结果

从图3可见，在B泳道中31kD稍下的位置，出现了相对A泳道中同样位置表达增加的蛋白条带，理论上应为GST蛋白；在D泳道中66.2kD稍下的位置，出现了相对C泳道中同样位置表达增加的蛋白条带，理论上应为GST-GAPDH蛋白。但该方法只是根据蛋白分子量大小进行判断，并不具有特异性，即使表达量增加的蛋白大小符合预期，也无法完全确定该蛋白就是目的蛋白，这就引发了学生对结果的质疑。

为此，分子生物学实验课程组结合本科实验教学特点，在原有教学内容的基础上设置了“免疫印迹法检测目的基因在原核细胞中的表达”这一综合性实验。该实验能够与原有教学内容相互验证、融会贯通，是对基础性实验教学的必要补充与延伸［11］。

6.2 教学模式

由于本实验内容具有较强的连贯性和综合性，对学生的理解能力、操作能力和分析能力都有着较高的要求。而基础实验课程受众面广，学生水平参差不齐，且一定程度上受到课时的限制。为不增加学生的学习负担，实验首先面向对该内容感兴趣并且学有余力的学生开设，即在完成基础分子生物学实验教学后，本着学生自愿参加的原则，根据报名人数进行分组，每组2或3人。教师首先进行必要的理论讲解、思路引导以及相关仪器操作示范，每组学生可自行制定实验方案，如诱导条件（IP TG浓度、诱导时间、诱导温度）、抗体种类（抗GST抗体、抗GAPDH抗体）以及电泳转印方法（湿转、半干转）等。在随后的教学过程中，教师只进行必要的答疑解惑，学生可根据自己的时间安排实验进度。实验结束后，要求每组学生对自己的实验结果进行汇报展示，由师生一起对实验过程中出现的问题及实验结果进行讨论与点评，让每个学生都能从他人的工作中总结经验，吸取教训，取长补短。这样的研讨式分组教学模式，既能够避免教学中因扎推操作而造成的拥挤现象，大大增加了学生亲自动手实践的机会，更充分突出了学生的主体地位，调动了学生的学习积极性，对于培养学生发现问题、分析问题和解决问题的综合实践能力起到积极作用［12］。

6.3 教学探讨

6.3.1 两种转印方法的比较

蛋白质电泳转印通常有湿转和半干转两种。二者的原理和过程基本相同。所不同的是，湿转是将三明治结构全部浸于电转移缓冲液中，而在半干转中只有滤纸起到储存电转移缓冲液的作用。因此，前者缓冲液用量大，导电能力强，适于长时间转印，但需要配备冷却系统，以分散较长时间转印所产生的热量；而后者其缓冲液用量少，无需冷却装置，使用方便，但缓冲能力有限，所以转印时间不宜过长，更适于快速转印。由于分子量较大的蛋白在短时间内快速转印的转移效率较低，因此，湿转的转移蛋白分子量范围要更广一些［7-8］。本实验的目的蛋白大小适中，对于两种转印方法均适用，因此每组学生可以自由选择尝试，以提高学生的主观能动性和综合实践能力［13］。

6.3.2 一膜多用

本实验中pGEX-4T-2空载体表达GST标签蛋白（大小约26 kD），pGEX-4T-2／GAPDH重组质粒表达GST-GAPDH融合蛋白（大小约63 kD），因此实验中选用抗GST抗体进行目的蛋白的检测。值得一提的是，由于编码GAPDH蛋白的基因来自小鼠，因此，在本实验结束后，还可以利用膜再生液将膜上的封闭蛋白及抗体除去，经再次封闭后选择鼠源抗GAPDH抗体重新孵育。又或者，在PVDF膜第一次封闭后，根据膜上Marker大小将膜剪开，分子量较小的部分孵育抗GST抗体，分子量较大的部分既可以孵育抗GST抗体，也可孵育抗GAPDH抗体。学生可以根据不同抗体的杂交结果进行讨论和分析，在掌握一膜多用的操作方法基础上，进一步深化对免疫印迹技术的理解和认知。

6.3.3 检测和成像方法的选择

Western Blotting对目的蛋白的检测方法主要取决于二抗的标记类型，不同的标记则需要采取不同的方式方法进行检测。本实验用到的是目前最为常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记的酶联二抗，检测方法则选用反应速度快、灵敏度高的增强化学发光法（ECL），其原理是辣根过氧化物酶可以催化相应底物发生化学反应，产生发光产物，进而可以利用胶片曝光或CCD系统成像。胶片曝光与CCD系统成像相比，前者需要利用胶片在暗室中进行时间梯度的显影和定影，成本高，耗时长，过程繁琐，对于本科生而言操作难度较大，且相关试剂因具有一定的毒性还会给实验教学带来安全隐患；而CCD成像速度快，操作简单安全，无需耗材成本，不仅具有高灵敏度和高分辨率，还能够利用软件对结果进行准确计量，因此更适于实验教学。

6.3.4 上样量的校正

蛋白免疫印迹法主要用于比较不同条件下目的蛋白的相对变化，而比较的基础就是等量的样品上样量。目前，最为常用的校正上样量的方法则是在检测目的蛋白的同时检测内参。即内部参照，通常是指管家基因表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达水平相对恒定，基本不受环境因素的影响。内参的检测不但能够起到校正上样量的作用，还可以检验实验体系是否正确稳定，用以排除由于人为等因素给实验造成的影响。内参蛋白的选择通常要考虑到样本种属、与目的蛋白之间的大小差异以及是否有可用抗体等多种因素。本实验所用材料为大肠杆菌，理论上可选择其内源性的GAPDH作为内参，但目前市售的抗体鲜有大肠杆菌来源，虽有文献报道用鼠源抗GAPDH抗体可以代替，但检测效果不甚理想，需要对抗体的稀释度和曝光时间等条件进一步摸索和优化［1-2］。

7 结 语

将科研领域中常用技术手段打造成适于本科教学实践的实验内容一直是高校教学改革的重要方向之一［14-15］。为此，我校生物实验教学中心分子生物学课程组开设了“免疫印迹法检测目的基因在原核细胞中的表达”这一综合性项目作为对基础性实验教学的扩展。通过优化的实验内容和合理的教学设计将蛋白质免疫印迹技术引入本科实验教学，并结合学生基础和教学实际，采取研讨式分组教学模式，让学生在学习实验技能的同时，有更多独立操作与思考的空间，和更多相互交流与借鉴的机会，充分发挥其主观能动性，使学生的思维方式和实验素养都能得到严谨性、科学性和系统性的训练，这也是高校创新型人才培养的必然要求［16］。