“基因工程学”教学中基因扩增克隆及表达实验设计

贾立军

（延边大学农学院，吉林延吉133002）

0 引 言

基因工程学是生命科学领域的核心课程，其内容包括基因操作技术原理、基因克隆的酶学基础、质粒载体、基因的分离鉴定与表达等［1-2］。实验课程设计是对理论课程学习的实践操作，目的是使学生能够真正做到理论联系实际，掌握基因工程的基本实验技能，进而培养学生的创新思维、创新意识以及实践动手能力［3-5］。

新孢子虫是寄生于多种哺乳动物细胞内的一种原虫，是引起牛流产、死胎及神经症状的主要病原体，是危害养牛业健康发展的主要因素［6-7］。NcAMA1基因是新孢子虫由微线分泌的典型跨膜蛋白基因，在侵染宿主细胞的过程中具有介导黏附和入侵宿主细胞的作用，是新孢子虫目前研究的热点基因之一［8］。基因工程学实验教学中以新孢子虫为实验材料，以NcAMA1基因为研究对象，对学生进行基因工程学实验技能训练。学生在老师的指导和查阅相关文献的基础上，设计实验技术路线，通过具体的实验操作和科研训练，学习并掌握了实验技能，从而激发了学生创新性探索精神，培养了学生独立分析和解决问题的能力，促进了学生理论知识与实验技能的相互融合［9-11］。

1 实验原理与实验材料

1.1 实验教学设计原理与技术路线

以新孢子虫为实验材料，提取新孢子虫基因组DNA，设计NcAMA1基因特异性引物，以新孢子虫基因组DNA为模板，PCR扩增NcAMA1基因，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的PCR产物回收，连接pMD-18T Sample vector克隆载体，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的克隆质粒回收目的基因，再连接pVAX1真核表达载体，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的真核表达质粒转染Vero细胞，最后应用间接免疫荧光（IFAT）检测NcAMA1基因在Vero细胞中表达。具体实验技术路线如图1所示。

图1 NcAMA1基因扩增、克隆及真核表达实验技术路线

1.2 实验教学材料

新孢子虫和Vero细胞由学校预防兽医学实验室保存、培养；基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、限制性内切酶EcoR I、BamH I，ExTaq、T4 DNA 连接酶、DL15000 Marker、DL2000 Marker、Lipofectamine 2000等均购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α感受态细胞由预防兽医学实验室制备；pMD-18T Sample vector克隆载体、pVAX1真核表达载体由预防兽医学实验室保存；荧光素（FITC）标记的抗牛IgG购自美国Sigma公司，牛新孢子虫阳性血清由预防兽医学实验室制备；DMEM培养基、犊牛血清、胰蛋白酶、双抗、细胞培养瓶购自哈尔滨东山科技有限公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯级。

1.3 实验引物设计与合成

根据GenBank上登录的新孢子虫（登录号：AB265823.1）NcAMA1基因序列开放阅读框，应用Oligo 6.0软件设计引物，酶切位点EcoR I和BamH I（引物序列中下划线标记）。引物序列：上游引物P1：5’-CCGGAATTCGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGA GTA-3’；下游引物P2：5’-CTAGGGATCCTTAAGAATC CGAAACCAGGCA-3’。由上海英骏生物技术公司合成。

1.4 实验仪器与试剂

仪器：PCR 扩增仪（德国eppendorf）、FluorChem FC2 System成像系统（美国UVP）、二氧化碳培养箱（日本三洋）、WD-2101A型电泳系统（北京六一仪器厂）；台式高速离心机（西格玛公司）；ES-315高压灭菌锅（TOMY）；TE2000倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）。

试剂：细胞培养所用试剂（PBS缓冲液）；琼脂糖凝胶电泳所需溶液（0.5 mol／L EDTA、50 × TAE 电泳缓冲液、10 mg／mL EB）；基因克隆、酶切所需试剂（50%丙三醇溶液、LB液体培养基、LB固体培养基）；IFAT试验所用试剂（PBS溶液、固定液、血清稀释液、荧光二抗稀释液、磷酸盐缓冲甘油、洗涤液），所用试剂溶液均需实验前配制完成。

2 实验步骤

2.1 基因组DNA的提取

按照常规细胞与虫体培养方法复苏、培养Vero细胞和新孢子虫，按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取新孢子虫基因组DNA。

2.2 目的基因PCR扩增

以提取的新孢子虫基因组DNA为模板，应用引物P1和P2进行PCR扩增。PCR扩增体系为：模板DNA 1.00 μL，dNTP 2.50 μL，Buffer 2.50 μL，引物P1 1.00 μL，引物P2 1.00 μL，Ex Taq 0.25 μL，ddH20 16.75 μL。总体系为25 μL。PCR反应条件如图2所示，30个循环。PCR产物经10 g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，应用DNA凝胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物，于-20℃储存备用。

图2 PCR反应条件

2.3 目的基因克隆与鉴定

将回收的目的基因NcAMA1与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接4℃过夜，连接体系为：目的基因NcAMA1 4 μL，pMD18-T Simple Vector 1 μL，Solution 5 μL。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含Amp固体LB平板挑选阳性克隆，摇菌过夜后，提取质粒DNA进行PCR鉴定和双酶切鉴定。PCR鉴定方法按照PCR扩增体系和图2进行；EcoR I、BamH I双酶切反应体系为：pMD18T-NcAMA1 10 μL，Buffer（10×H）2 μL，EcoRⅠ 1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O 6 μL。

2.4 真核表达质粒的构建与鉴定

应用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切重组克隆质粒pMD18T-NcAMA1和真核表达载体pVAX1。分别回收目的基因NcAMA1和真核表达载体pVAX线性片段，应用T4 DNA连接酶连接，反应体系为：NcAMA1 10 μL，pVAX 线性DNA 片段3 μL，10 ×Ligation buffer 2 μL，T4 DNA 连接酶1 μL，ddH2O 4 μL。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含Amp固体LB平板挑选阳性克隆，摇菌过夜后，提取质粒DNA进行PCR鉴定和双酶切鉴定。PCR鉴定方法按照PCR扩增体系和图2进行；EcoR I、BamH I双酶切反应体系为：pMD18T-NcAMA1 10 μL，Buffer（10×H）2 μL，EcoRⅠ1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O 6 μL。将鉴定正确真核表达质粒命名为pVAX-NcAMA1。

2.5 重组真核质粒转染Vero细胞

转染前准备：将37℃、5%CO2细胞培养瓶培养的Vero细胞传入24孔细胞培养板中，培养细胞单层生长至板底的80%左右，吸弃DMEM培养液，用无Ca2＋、Mg2＋的PBS 将细胞洗涤3 遍。同时，将6 μL pVAX-NcAMA1加入到94 μL无血清和抗生素DMEM的1.5 mL 离心管中；将3 μL Lipofectamine 2000 加入到97 μL无血清和抗生素DMEM的1.5 mL离心管中。室温静置5 min后，将两个离心管中液体混合到一个1.5 mL离心管中，混匀，室温静置30 min。

细胞转染：将1.5 mL离心管中混合液加入已洗涤3遍的24孔板Vero细胞中，然后每孔加入500 μL无血清和抗生素DMEM。于37℃、5%CO2培养箱中培养4～6 h后，吸弃培养液，每孔加入2 mL含20%血清的DMEM继续培养48 h，期间更换一次培养液。

2.6 间接免疫荧光检测（IFAT）

pVAX-NcAMA1转染Vero细胞48 h后，用PBS洗涤Vero细胞3次→10%冷丙酮固定10 min→PBS洗涤3次→加入一抗（1∶200稀释牛新孢子虫阳性血清）→37℃孵育1 h→PBS洗涤3次→加入二抗（1∶2 000稀释FITC标记抗牛IgG）→37℃孵育1 h→PBS洗涤3次→倒置荧光显微镜下观察并照相。

3 实验结果与分析

3.1 目的基因PCR扩增与克隆

以新孢子虫基因组DNA为模板，应用引物P1和P2扩增，得到如图3所示大小为679 bp NcAMA1基因片段，说明PCR扩增目的基因实验结果正确。重组克隆质粒pMD18T-NcAMA1经PCR鉴定和双酶切鉴定，获得如图4所示的2 692 bp和679 bp片段，说明目的基因克隆实验结果正确。

图3 NcAMA1基因的PCR扩增

图4 pMD18T-NcAMA1的双酶切鉴定结果

3.2 目的基因真核表达质粒的构建及真核表达

对构建的pVAX-NcAMA1重组真核表达质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，PCR扩增目的片段大小为679 bp，说明PCR鉴定实验结果正确。BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切获得679 bp目的基因片段和2 999 bp真核表达载体片段，说明pVAX-NcAMA1真核表达质粒构建正确。pVAX-NcAMA1质粒转染Vero细胞后，IFAT检测，如图5所示，Vero细胞中出现绿色荧光，说明NcAMA1基因在Vero细胞中获得瞬时表达。

图5 IFAT检测NcAMA1基因在Vero中表达（400×）

4 结 语

基因工程学课程是一门承上启下的尖端课程，也是连接本科生和研究生之间的纽带课程［12］。基因工程学实验课的学习直接关系到本科生的毕业论文设计、大学生创新创业训练项目立项结题以及研究生课题试验，生物技术专业本科生80%以上的毕业论文设计和大学生创新创业训练项目均涉及到基因工程学实验内容［13-14］；而研究生课题试验也需要掌握PCR扩增、基因克隆表达等最基本实验技术。因此，学生认真学习并掌握基因工程学的实验技能至关重要［15-16］。

基因工程学实验教学的整个实验过程包括基因组DNA的提取、目的基因PCR扩增、目的基因与克隆载体连接、重组克隆质粒构建、克隆质粒PCR鉴定和酶切鉴定、目的基因与表达载体连接、重组表达质粒构建、表达质粒PCR鉴定和酶切鉴定、目的基因转染真核细胞表达蛋白、以及IFAT检测等10个连续实验内容的贯穿。让学生真正实现了基因工程学课程全部理论知识应用于生产实践的目标。整个实验过程既包括基因组学、生物化学、物理学及计算机软件知识，也包括免疫学、细胞生物学及蛋白质学等知识，让学生领会到了不同学科知识的融会贯通；也让学生学习到了PCR扩增、蛋白质表达、免疫学检测等技术方法。

在老师的指导和学生的共同努力下，学生通过自主学习，独立完成了NcAMA1基因的克隆表达，并应用免疫学方法对表达蛋白进行了检测。通过对整个实验的实践操作，学生可以独自完成对已知基因的PCR扩增、克隆及表达的实验验证，也可以对未知基因的功能进行探索研究。从而激发了学生自主探究的兴趣，为创新思维的形成打下了良好基础。从理论联系实际，再到实践操作，进而对科研的探索，最终培养了学生认识问题、分析问题、解决问题的能力。