国产弹性蛋白酶浸泡法构建兔腹主动脉瘤及其随访

毕永华，伊梦飞，陈红梅，韩新巍，任建庄，尉泽鹏

腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）常发生于肾下腹主动脉，特征性表现为血管壁慢性炎性浸润、弹力纤维降解及中膜变薄，但确切发病机制尚不清楚。采用弹性蛋白酶腔内灌注或氯化钙浸泡等化学损伤法构建小型动物模型，常用于病因学和干预治疗的基础研究[1-8]。弹性蛋白酶血管腔内灌注法多见于构建啮齿类动物模型，但建模方法操作复杂，需要经髂总动脉插管，且灌注过程中需阻断腹主动脉血流并防止溶液渗漏。相比之下，主动脉周氯化钙浸泡法较为简单、易行。通过在主动脉周浸泡弹性蛋白酶溶液也可诱导AAA 形成[8-10]。White 等[9]将 肾 下 腹 主 动 脉 段 浸 泡 于20 U/μL 弹性蛋白酶溶液70 min，成功构建AAA 模型。然而Origuchi 等[10]研究发现，主动脉周弹性蛋白酶浸泡法诱导的兔AAA 存在自愈现象，术后6 周瘤体逐渐缩小，3 个月时主动脉直径几乎恢复正常，这与人类AAA 临床表现不相符。此外，以往弹性蛋白酶一般浸泡2～3 h，建模时间较长，影响手术成功率。采用国产猪胰弹性蛋白酶浸泡法建模鲜见报道，我国学者也往往采用美国Sigma 公司和Calbiochem 公司弹性蛋白酶灌注法建模，价格较昂贵。本研究尝试采用国产猪胰弹性蛋白酶并缩短浸泡时间快速构建兔AAA 模型，并随访长期稳定性，观察是否也存在自愈现象，以评价其应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验分组

本研究遵循实验动物保护条例和使用标准，并获得郑州大学动物保护和使用委员会批准。24 只雄性新西兰白兔，平均体重（3.0±1.1） kg，随机分成实验组、对照组，每组各12 只。实验组采用10 μL浓度为10 U/μL 国产猪胰弹性蛋白酶溶液浸润主动脉近分叉处血管段30 min，对照组采用0.9%氯化钠溶液10 μL 浸润30 min。

1.2 AAA 模型构建

分别按0.3 mL/kg 和0.7 mL/kg 体重肌内注射速眠新Ⅱ和3%戊巴比妥溶液麻醉，兔仰卧位固定于手术台上，腹部备皮；聚维酮碘消毒、铺巾，沿腹白线剖腹，充分暴露腹主动脉，距分叉0.5 cm 处开始向近心端游离出长约1 cm 腹主动脉段；以套有塑料软管弯镊支撑，使腹主动脉游离段悬空，无需阻断动脉血流；将大小约3 mm×4 mm 面巾纸贴于外壁上，实验组以微量移液器滴加10 μL 弹性蛋白酶溶液（M0139，活力≥30 U/mg，上海楷洋生物技术公司），首滴为4 μL，随后每5 min 滴注2 μL，避免溶液渗漏（图1），对照组同法滴注0.9%氯化钠溶液10 μL；浸泡30 min 后移去纸片，用0.9%氯化钠溶液冲洗2 次，避免溶液残留；逐层缝合，将兔送回笼子。

图1 动物模型构建

1.3 观察指标

①主动脉直径：术前和术后5、15、40、100、150 d，分别经耳缘静脉造影，测量主动脉内径。留置24 G静脉输液针，快速推注约6 mL 对比剂。主动脉内径较术前增大50%以上视为AAA 形成。②病理学改变：术后5、15、150 d 造影完毕两组分别处死4 只兔，对浸泡段主动脉取材，固定于4%多聚甲醛溶液，作苏木精-伊红（HE）、弹力纤维EVG 染色，观察主动脉形态学改变和弹力纤维变化。③免疫组化：同时采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）法染色，观察基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和小鼠抗兔巨噬细胞抗体（rat anti-rabbit macrophage antibody，RAM）-11 表达。以1%过氧化氢孵育15 min，10%山羊血清封闭后加一抗4℃过夜。生物素化山羊抗小鼠IgG 室温孵育20 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，中性树酯封片。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0 软件作统计学分析，数值以均数±标准差（）表示，t 检验分析两组内径变化，P＜0.05 时认为差异有统计学意义。

2 结果

主动脉直径测量显示，实验组兔术后即刻可见直径明显增大，术后5 d 均形成AAA，术后15 d 进一步增大，显著大于对照组兔（P＜0.000 1）；术后40 d 稍缩小，但100 d 直径基本稳定，仍大于对照组（P＜0.05）；术后150 d 直径明显缩小。对照组未见AAA 形成，直径无明显变化（图2）。

图2 主动脉直径变化趋势

组织学分析显示，实验组术后5 d血管壁结构紊乱，中膜变薄，大量红细胞渗出，伴炎性细胞浸润，弹力纤维几乎消失，仅可见少许残留片段；术后15 d血管壁规则，部分管腔可见少量内膜增生和残留的弹力纤维；术后150 d 内膜、中膜明显增厚增厚，形态较规则，可见新生弹力纤维，但纤细、排列紊乱，与对照组规则结构有所不同。对照组动脉内膜、中膜和外膜结构完整，内、外弹力层和中膜弹力纤维层排列规整、连续，呈波浪状，未见断裂、碎裂（图3）。

图3 病理学变化

免疫组化分析显示，实验组术后5 d 可见残留的平滑肌细胞表达MMP-2，伴炎性细胞浸润，血管各层可见大量MMP-9 和RAM-11 阳性表达；术后15 d 中膜和外膜可见少量散在MMP-9、RAM-11 阳性表达，平滑肌细胞内MMP-2 呈强表达；术后150 d几乎未见MMP-9、RAM-11 阳性表达，MMP-2 呈中度表达。对照组未见阳性细胞表达（图4）。

图4 免疫组化染色结果

3 讨论

AAA 主要危害在于瘤体持续扩张，最终导致破裂，甚至死亡。其确切发病机制尚未完全明确，需多种AAA 模型进一步研究[2，11-12]。弹性蛋白酶腔内灌注法常用于小型动物AAA 模型构建，但建模时需要经髂总动脉插管，且灌注过程中需阻断腹主动脉血流，并防止溶液渗漏。该建模方法复杂，手术难度大，且死亡率高、并发症多。主动脉周浸泡弹性蛋白酶溶液也可诱导AAA 形成，但该模型3 个月时几乎恢复正常，这与人类AAA 临床表现不相符[5]。因此，构建一种更简易、稳定的模型十分必要。

White 等[9]通过弹性蛋白酶浸泡法成功构建兔AAA 模型，但弹性蛋白酶一般浸泡2～3 h，建模时间较长，影响手术成功率。我国学者往往采用进口弹性蛋白酶灌注法建模，采用国产猪胰弹性蛋白酶浸泡法建模鲜见报道。本实验采用浓度为10 U/μL国产猪胰弹性蛋白酶，只需浸润30 min，术后5 d 即可形成动脉瘤，浸润时间比以往研究大大缩短。与弹性蛋白酶腔内灌注方法相比，该方法无需穿刺髂动脉、阻断血流，故简单易行，创伤小。

Origuchi 等[10]研究提示主动脉周弹性蛋白酶诱导的动脉瘤可自行愈合，发现术后42 d 动脉逐渐缩小，90 d 时主动脉直径几乎恢复正常；认为平滑肌细胞不可逆性损害对动脉瘤形成是必须的。本研究发现，术后150 d 主动脉直径明显缩小，内膜过度增生，可见大量纤细弹力纤维再生；尽管该模型有自愈倾向，但100 d 内直径基本保持稳定，有助于AAA机制研究，这与Origuchi等[10]报道的观点有所不同。

本实验结果表明，国产猪胰弹性蛋白酶溶液浸泡法可诱导兔AAA 形成。该方法操作简单、安全、有效。该模型有自愈倾向，但100 d 内基本稳定，有助于AAA 机制等进一步研究。