基于体外染色体畸变试验评价纳米银敷料遗传毒性的研究

广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510080）

内容提要： 目的：通过体外染色体畸变试验来检测纳米银敷料引起遗传毒性的可能性，为临床前安全性评价提供资料与提示。方法：根据《GB/T16886.3-2008/ISO 1099-3:2014》中推荐的方法选用中国仓鼠肺细胞（CHL）进行体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（CAT），在代谢活化系统（+S9）与非代谢活化系统（-S9）条件下，检测纳米银敷料浸提液在+S9/6h、-S9/6h、-S9/24h三种处理条件下诱发CHL细胞的染色体畸变率。结果：纳米银敷料各处理组的染色体畸变率与阴性对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。在与CHL接触24h后，细胞出现了明显形态改变。结论：在该试验条件下，纳米银敷料浸提液对CHL细胞的染色体无明显损伤作用，在24h接触组中出现了明显的细胞毒性。

纳米材料因其独特的物理化学性质，以及能够与生物体发生高度活性的相互作用，广泛应用于多种领域，具有广阔前景。纳米银抗菌医用敷料是一种采用纳米技术，以纳米级别的超细银颗粒载于医用无菌纱布、非织造布、医用脱脂纱布或功能相当的其他医用纤维制品组成的医疗器械。一般分为自粘型和非自粘型两种类型。其中，无纺布、纱布或功能相当的其他医用纤维制品抗菌敷料分为自粘型和非自粘型两种类型，脱脂针织纱布抗菌敷料为非自粘型，可用于烧烫伤、手术切口和皮肤感染伤口的辅助治疗。纳米银是一种安全环保的天然杀菌剂，这种含纳米银的敷料能抑制与之相接触的病原体，防护或辅助治疗创面感染，从而加速创面愈合。此外由于纳米银敷料能持续释放纳米银，可以减少换药次数，减轻换药痛苦，节约治疗成本。纳米银抗菌医用敷料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的生长有明显抑制作用[1]。与此同时，其可能存在的安全风险问题也备受关注。

遗传毒性试验是非临床安全性评价的一个重要内容，通过一系列试验评价材料是否有遗传毒性，对材料的致癌性有一定的预测作用，从而降低人群危害风险。而对纳米材料的遗传毒性进行评价具有一定的特殊性，纳米材料因为其尺寸效应等特点而易于出入细胞，并可在细胞内蓄积，与细胞遗传物质产生直接或者间接的相互作用。研究发现，纳米银不仅可诱导细胞凋亡，还会引起DNA损伤的增加，不同粒径的纳米银颗粒影响具有差异[2]。纳米材料也易于在肝脏和免疫器官等部位分布蓄积，对于是否会因长期滞留于脏器内而诱发肿瘤也是遗传毒性研究中需要考虑的一个因素。由于没有单独一个遗传毒性试验方法可检测所有的遗传毒性终点，遗传毒性的评价大多采用组合试验的方法，国内医疗器械遗传毒性评价试验室一般的试验组合为Ames试验，小鼠淋巴瘤细胞基因突变试验（MLAT）和体外染色体畸变试验（CAT）[3,4]。体外染色体畸变试验可以直接对细胞内的染色体结构和数目进行细微观察，可以快速直观判断染色体数目异常和结构变化异常，是最基本、重要的遗传毒性评价方法之一，具有重要价值。本文主要介绍以体外哺乳动物细胞染色体畸变试验对纳米银敷料进行评价。

1.材料与方法

1.1 一般材料

样品与对照品：本次体外染色体畸变试验采用三种纳米银敷料产品，分别为样品A、样品B、样品C。这三种产品基本涵盖了目前临床上使用的主要纳米银敷料类型，样品A由无纺布和敷料海绵组成，样品B由敷料海绵组成，样品C由脱脂针织纱布组成。分别用相应的浸提介质吸足液体后，按照0.2g/mL的比例加入含血清培养基（购自Gibco），在37°C条件下浸提48h，所得浸提液为供试品液。阴性对照（浸提介质）为含血清培养基。阳性对照的选择为在非活化代谢条件下选用甲磺酸甲酯（MMS，购自Sigma）作为阳性对照，在活化代谢条件下选用环磷酰胺（CP，购自阿拉丁公司）[5]。

细胞株和主要仪器：细胞株为中国仓鼠肺细胞（Chinese Hamster Lung Cell，CHL），购于中国科学院上海细胞生物研究所；倒置显微镜，购于Olympus公司；普通光学显微镜，购于徕卡公司；二氧化碳培养箱、冷冻离心机，均购于美国Thermo公司。

培养基与试剂：细胞培养液由RPMI 1640培养基、青链霉素混合液（终浓度1%）、小牛血清（终浓度10%）配制而成，均购自Gibco。秋水仙素配制成5mg/mL，稀释后使用（SIGMA，终浓度1μg/mL）。吉姆萨染液购自索莱宝，甲醇购自广州化学试剂厂，冰乙酸购自广州市东红化工厂。

代谢活化系统：S9由苯巴比妥钠与β-萘黄酮联合诱导处理大鼠肝而获得，购买于Moltox公司。本试验中所用S9混合液（S9mix）中的S9含量为10%，检测时现用现配，S9与0.2mol/L的PBS、1.65mol/L的KCl、0.4mol/L的MgCl2、0.05mol/L的Glucose-6-Phosphate、0.025mol/L的NADP配制成S9 mix[6]。大鼠肝S9包括肝微粒体和胞质酶，是体外遗传毒性试验常用试剂，用以模仿受试物体内代谢活化过程。然而S9本身有一定细胞毒性，因此在添加S9进行活化的实验系统中，给药处理时间通常不超过6h[7]。

1.2 方法

接触处理：试验前接种一定数量细胞，置于CO2培养箱培养。细胞长到近汇合状态后弃培养液，加入对照品或供试品、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足），置于培养箱中。活化代谢组接触6h后吸去培养皿中的液体，用PBS清洗细胞3次，加入含血清培养基继续培养，于24h内收获细胞。非活化代谢组接触时间为6h和24h。收获前4h加入终浓度为1μg/mL秋水仙素。阴性对照组和阳性对照组同法制备。

收获细胞与制片：消化细胞后加含血清培养液收集细胞。加入0.075mol/L氯化钾溶液低渗处理后，加入固定液进行固定，固定结束后离心弃上清，加入数滴新鲜固定液滴片，空气干燥后用姬姆萨染液染色。

结果分析：在光学显微镜下每一试验组选择200个分散良好的中期分裂相观察染色体畸变的情况。在SPSS软件上采用χ2检验对各组染色体畸变率进行统计学分析。

2.染色体畸变试验结果分析

2.1 细胞毒性

根据相对细胞增长数RICC来评估供试品的细胞毒性，与6h接触组比较，三种纳米银敷料浸提液接触24h后的RICC明显降低，RICC分别为20.4%、31.0%、28.1%（表1），结果表明CHL细胞与纳米银敷料浸提液接触24h后均出现了明显的细胞毒性，镜下观察表现为细胞形态的变化（图1），细胞膨大、变长、胞内小泡颗粒增多，部分细胞死亡脱落或者固缩变圆。而阴性对照组未出现明显的细胞生长抑制和形态上的改变，细胞呈梭形，不规则形状，胞体贴壁铺展均匀。

2.2 染色体畸变结果

纳米银敷料浸提液对CHL细胞染色体畸变作用的试验结果显示，在加入S9混合液与不加S9混合液条件下所诱发的染色体畸变率均＜5%，其畸变率与阴性对照组相比差异均无显著性。在同一条件下，阳性对照中非代谢活化组的甲磺酸甲酯诱发产生的畸变率为14.5%（6h）和18.5%（24h），代谢活化组的环磷酰胺诱发产生的畸变率为20.5%，与阴性对照组相比差异均具有显著性（表1），这表明该实验系统成立可靠。另外，三种纳米银敷料各试验组均观察到多倍体细胞（图2）。

式中：RICC——细胞相对增长数；d1——试验样品培养物中细胞的最终数量；d0——试验样品培养物中细胞的起始数量；D1——对照品培养物中细胞的最终数量；D0——对照品培养物中细胞的起始数量。

3.讨论

图1. 各组接触24h后镜下观察的CHL细胞形态（1a：对照组；1b：样品组）

图2. 油镜下观察的染色体形态（2a：多倍体；2b：正常染色体）

本实验通过浸提的方式得到供试品液，以其与CHL细胞直接接触，在6h和24h分别收获细胞，进行染色体结构畸变分析，结果显示各试验组的CHL细胞染色体畸变率与阴性对照相比在统计学上均无显著性差异性，且染色体畸变率均＜5%。而阳性对照中非代谢活化组的甲磺酸甲酯和代谢活化组的环磷酰胺均显示出明显的阳性反应。上述结果显示，在本试验条件下，未检测出纳米银敷料浸提液对CHL细胞染色体具有明显的损伤作用。但是研究结果还显示纳米银敷料在不同条件处理下均出现了多倍体细胞，多倍体是体外染色体畸变试验中的一种常见现象，但仅多倍体产生并不能提示受试物具有诱导非整倍体的潜力，而可能仅提示细胞周期紊乱[8]；多倍体也常常与细胞毒性的升高有关，这也与本实验计算出来的样品相对细胞增长数RICC降低相符合。

近年来，含银敷料逐渐广泛应用于临床，银离子本身带有抑菌杀菌功能，而纳米银作为一种特殊的银离子，具有比普通粒径的银离子更强效的抑菌作用，在医疗行业中被广泛应用于抗菌类医药和器械。目前对纳米银敷料的研究主要在于临床上的使用功效以及安全性等方面，对于毒理学方面的研究报告甚少，尤其是遗传毒性相关的方面。

表1.哺乳动物细胞染色体畸变试验结果

中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）是体外染色体畸变试验常用的细胞株之一，由于CHL细胞株的不同世代之间，在细胞周期时间和克隆形成率等参数上没有明显差异，便于控制实验条件，且不受动物体内营养及生理、免疫状态影响，因而能定量研究，重复性也好，且能传代保存，便于进行形态学和超微结构等观察，并进行细胞化学、生物化学等分析，被广泛用于染色体畸变试验的研究[9]。在于永生等[10]的研究中曾提出，肺脏是纳米银吸入染毒易损伤的靶器官，因此本研究采用CHL细胞为研究对象对纳米银敷料的遗传毒性进行评价，可以更好地探索纳米银敷料的细胞毒性，从而分析细胞增殖能力与遗传物质损伤之间的潜在联系。为了排除因细胞毒性的影响而可能出现的假阴性和假阳性结果，需要在后续的试验中设置不同剂量组计算纳米银敷料对CHL细胞的IC50值，进一步对纳米银敷料的遗传毒性进行深入研究评价。这也可以为纳米银产品的安全性评价以及相关的风险评估提供相应依据。